3D окрашивание волос: технология, способы

Автор Екатерина Юрченко На чтение 4 мин. Обновлено 08.12.2020

Содержание статьи

Натуральный и многогранный оттенок волос при окраске до некоторого момента считался сложно-достижимым. Каждая девушка, решившая покрасить волосы, понимала, что добиться многогранности и естественности в образе с окрашенной шевелюрой будет непросто.

Однако, современные технологии в разработке красителей и техник окрашивания не стоят на месте, а значит, пришло время новой эпохи в окрашивании волос. Читайте про новую технику окрашивания – Air Touch.

3D окрашивание волос – это техника, при которой достигается голографический объемный эффект за счет чередования нескольких оттенков и профессиональных красителей.

Мало кто осознает, почему естественный цвет волос выглядит глубже и объемней, нежели полученный даже профессиональной краской. Все дело в неравномерности цветового оттенка. Естественные волосы сочетают разнообразную гамму близких цветов, чем и достигается неоднородность и голографический эффект. На свету пряди выглядят так, а вот в потемках совершенно иначе. Сейчас красители профессионального уровня разработаны таким образом, что не окрашивают плотным монолитным цветом. А в сочетании с техникой 3 d окрашивания волос, такой результат становится легко достижимым.

Восхитительный темный цвет Натуральное золотисто-пшеничное окрашивание

Особенности

Ключевая особенность этой технологии заключается в использовании смежных оттенков и схеме нанесения красящего пигмента. Прежде всего, стоит отметить, что 3 d окрашивание волос подразумевает наличие одного базового цвета (он же наносится на корни) и одно или двух (а порой и более) дополнительных тонов.

Объемное окрашивание на светлых волосах Соединение трех оттенков одной гаммы

Отличие от колорирования заключается в том, что все тона находятся в пределах одного цвета, поэтому переход получается плавный и естественный. Кроме того, такое сочетание дает эффект отличительного объема, а также полноты и глубины цвета.

При нанесении в первую очередь уделяется внимание затылочной и прикорневой части. Некоторые же пряди красятся дополнительным цветом для поддержания естественного перехода.

Схема окрашивания:

1. Затылочная часть и корни окрашивается базисным цветом.
2. От затылка идет несколько прядей, толщиной в полтора сантиметра, которые прокрашиваются более светлым оттенком.
3. Опускаясь к низу затылка происходит чередование светлого-темного оттенка.
4. Тот же принцип соблюдается при переходе к височной доле, однако стоит учесть, что первая прядь окрашивается базисным цветом.
5. Та же схема просматривается на теменной области, которая прокрашивается последней.

Таким образом, можно видеть, что как таковой точной методики окрашивания нет, ведь все зависит от количества оттенков и длины. Однако эти пять принципов помогут лучше разобраться в технологии окрашивания нового поколения.

Схема объемного окрашивания для цветных оттенков

На кого рассчитано 3 d окрашивание волос

Примечательно то, что данная техника позволяет добиться результатов на любые оттенки волос.

3Д для брюнеток и рыжих

Эффектно смотрятся с таким окрашиванием брюнетки, в гамме которых преобладают шоколадно-ореховые ноты, ведь жгучим черноволосым красавцам такой тип окраски ни к чему, оно будет мало заметно.

3D для блондинок

Великолепно будут выглядеть блондинки. Такой сложный цвет волос должен смотреться максимально естественно и гармонично, а не напоминать о кукле Барби. Поэтому 3 d окрашивание волос придется как раз кстати.

Стоит заметить, что такая техника еще молода, поэтому существует не так много мастеров, которые знают как  выполнить 3D окрашивание волос. Немногие колористы могут адекватно оценить ваши желания и подобрать необходимые оттенки. Поэтому, стоит уделить поиску мастера особое внимание и уж тем более не стоит пытаться воссоздать 3 d окрашивание в домашних условиях, ведь результат может оказаться непредсказуемым.

Блестящее 3d окрашивание Глубокий и насыщенный шоколадный оттенок

3D окрашивание волос. 115 фото и техника

Такое окрашивание позволяет придать цвету волос многогранности и естественности, ведь натуральный волос выглядит гораздо живее чем окрашенный, и все это благодаря присутствию в нем разных тонов, это можно увидеть на фото до и после.

3D окрашивание подразумевает один и тот же цвет, но разные его тона — этим и отличается от колорирования, которое сулит внесение контрастных цветов.

Кому подходит 3D окрашивание?

3D окрашивание подходит абсолютно всем, не зависимо от цвета волос. Как блондинка так и шатенка могут разнообразить свой цвет волос.

Тонким и редким волосам подобное окрашивание придаст объем, а окрашенные волосы будут выглядеть живо, как натуральные.

Брюнетки редко прибегают к 3D окрашиванию, ведь могучий и бархатный черный цвет лучше всего смотрится ровным тоном.

Виды 3D окрашивания

Блонды с 3D окрашиванием блестят золотыми переливами для теплых оттенков, а холодные блондинки окрашивают пряди пепельными бликами.

Русые цвета волос, окрашенные 3D технологией просто потрясающе выглядят, это видно на фото, которые опровергнут тот факт, что русый цвет волос — «мышиный». Темные и светлые, теплые и холодные русые волосы засияют пепельными и бронзовыми переливами.

Шатенки могут насытить свои волосы многогранными коричневыми цветами. 3D окрашивание позволит каштановым волосам сиять бронзой, холодным и шоколадным цветам проявить всю свою красноватую или сероватую глубину.

Рыжие девушки просто обязаны сделать такое окрашивание, ведь богатые медные оттенки смотрятся очень естественно с 3D окрашиванием и подходящим цветотипом лица. Темные и клубничные рыжие — все они потрясающе заиграют объемом и бликами.

Черные волосы можно лишь насытить бликами. Отдельные мягкие прядки будут окрашены в графитовый оттенок черного, что придаст волосам стальной блеск.

По фото ниже можно наблюдать невероятно красивые результаты 3D окрашивания на разных цветах волос.

Зд (3d) окрашивание волос: техника, фото и видео

Немногие женщины могут похвастаться густыми и шелковистыми локонами, непревзойденным объемом прически и пышностью прядей.

Окрашивание волос в технике 3д (3d) – это вариант объемной покраски блондинок и брюнеток, где три родственных цвета обыгрывают редкие волосы, визуально делают их гораздо гуще, как на фото и видео в статье.

Такой инновационный метод сравнительно недавно пришел на смену классическим одноцветным методам тонирования женской шевелюры. Узнаем о технологии три д более подробно…

Зачастую техника окрашивания 3 d – это окрашивание волос в 3 цвета. Специалисты-парикмахеры используют разные оттенки одно цвета, чтобы достичь пресловутого эффекта три д, когда волос на голове кажется значительно больше за счет игры и переливов оттенков.

Обычно темные оттенки используются для нижних слоев волос, средние – соответственно для средних, а самый светлый – для верхних прядей. Эта методика покраски выглядит очень привлекательно и эстетично, ведь волосы при таком окрашивании выглядят особо красивыми, их цвет выглядит очень глубоким и дорогим. Чудодейственная окраска волос, фото которой можно заметить на всех современных модницах, мгновенно наполняет волосы объемом, они кажутся более густыми, гладкими.

Окрашивание волос – технология настолько избитая, что, казалось бы, здесь уже ничего нового не придумать. Однако, 3d окраска вносит полезное разнообразие в ряд посредственных технологий, не зря она так полюбилась женщинам по всему миру. Объемное окрашивание волос, фото которого непременно сейчас имеется в любом модном журнале, является универсальным и подходит любой женщине. Такое окрашивание волос – это прекрасная альтернатива одноцветному окрашиванию, при котором волосы часто выглядят менее объемными, тусклыми и неинтересными.

Единственный минус этой методики – это ее сложность. Объемное окрашивание волос – техника не для домашних экспериментов, ведь только опытный профессиональный мастер сможет правильно подобрать тона и достичь того самого эффекта 3 d.

Сложен и процесс нанесения краски: сначала волосы разделяют на отдельные зоны, а затем каждую прядку прокрашивают в определенный цвет. Сначала – самый темный оттенок, затем – оттенок чуть посветлее, а после этого – самый светлый. Но при этом оттенки отличаются между собой совсем незначительно, благодаря чему резких переходов в тонах просто не будет. Согласитесь, все это достаточно сложно для человека неопытного.

Парикмахеры утверждают, что 3д окрашивание волос – это самая шикарная техника для темноволосых женщин. Благодаря игре бликов и света, темный цвет волос начинает выглядеть особенно шикарно. И если, к примеру, двухтональное окрашивание волос в основном показано светловолосым барышням, то три д окрашивание – наиболее удачный вариант именно для брюнеток.

В основном в этих случаях происходит 3 д окрашивание волос в шоколадные оттенки, фото готовой покраски буквально поражают своей красотой: волосы выглядят гораздо пышнее, интереснее, а их обладательница сразу становится будто бы свежее и моложе.

Вам также будет интересно почитать следующую статью «Красивые и необычные техники окрашивания темных волос: фото и видео».

3 d окрашивание волос – главная хитрость манекенщиц и моделей, девушки специально прибегают к такому методу окрашивания, чтобы их прическа на снимках всегда выглядела потрясающе.

Чтобы темные волосы сияли в лучах света и играли живыми переливали, мастера могут использовать в окраске от 3 до целых 7 оттенков одного цвета. Зачастую основной (базовый) тон подбирается мастером под натуральный оттенок волос женщины.

Покраска волос может занять много времени, иногда – до 4-5 часов. Держится эффект три д на волосах примерно 3-4 месяца, а затем понадобится коррекция.

Окрашивание волос для объема – это действенный прием и для блондинок, волосы которых часто страдают в процессе многочисленных обесцвечивающих процедур. Парикмахеры-стилисты добавляют побольше живых оттенков в однотонный блонд, чтобы он заиграл по-новому: золотистые и песочные тона способны оживить прическу, наполнить ее светом.

В то время, как окрашивание волос для брюнеток (фото которого зачастую является эталонным для наглядных примеров техники 3д) подразумевает наличие в основном теплых шоколадных, кофейных и золотистых тонов, блондинкам оттенок перелива подобрать могут и холодный. Это связано с тем, что у большинства темных волос подтон цвета – теплый. Блонд же с пепельным и холодным отливом встречается так же часто, как и пшеничный теплый.

Медовые, янтарные оттенки – не только прекрасные оттенки для золотистых блондинок, но и чудесный способ визуально скинуть пару-тройку лет, ведь теплые тона всегда немного молодят. 3 d окрашивание волос, техника, схема и хитрости его будут сложны для выполнения в домашних условиях даже для блондинок. Основная задача в три д окрашивании – это правильно выбрать все тона, которыми будет производиться окрашивание.

Многих обладательниц коротких волос часто смущает отсутствие объема и пышности у корней. В этом случае может помочь светлое 3 д окрашивание волос. Как известно – светлые тона всегда немного полнят, а светлые тона на голове всегда выглядят несколько гуще, чем темные. Специалисты применяют оксид 3 для окрашивания волос, чтобы осветляющий эффект был максимально натуральным, нерезким и плавным.

Однако и короткие стрижки на темных волосах выглядят прекрасно с этим видом окрашивания. Короткие волосы особенно эффектно смотрятся с окрашиванием три д: они будто сияют изнутри, выглядят наполненными энергией, здоровыми и блестящими. Такое окрашивание волос непременно стоит попробовать всем тем женщинам, которым надоела их привычная короткая стрижка, но обновить которую или варьировать не представляется возможным из-за недостаточной длины.

Похожие записи

Окрашивание гипсовых 3d панелей для стен

Достаточно кропотливый процесс, который подчас с одной стороны может быть выполнен человеком без особого опыта в подобных работах, и с другой стороны может выполняться лишь высококлассным специалистом. Почему так? Всё дело в рельефе гипсовых 3d панелей для стен, например панели с волнообразным рельефом красить достаточно просто, и если волна не сильно мелкая, то это вполне возможно сделать по средствам обычного строительного валика. А вот если они имеют геометрический рельеф, который имеет полости, до которых валик достать не сможет, то тут не обойтись без краскораспылителя пневматического, электрического или как идеальный вариант безвоздушного. Поэтому оптимальным решением и как заключительный этап монтажа гипсовых 3d панелей станет доверить эту работу специалистам. Так какую краску выбрать?

Варианты окрашивания гипсовых 3d панелей 

• Матовая 
• Глянцевая 
• Шелковистая
• Влагозащитная
• Перламутр
• Хром
• Золото

Матовая краска 

Наиболее популярные краски для окрашивания гипсовых панелей 3d. Благодаря матовости покрытия не создают на поверхности бликов.

А так же само окрашивание не представляет особых трудностей, если конечно швы между панелями качественно заделаны, и отсутсвует «блик шва». Условно матовые краски можно разделить на три типа:

• высокоматовые
• матовые 
• полуглянцевые

Наиболее популярные марки глубокоматовой красти для окрашивания гипсовых 3d панелей для стен: 

Высокоматовые:

• Dulux Bindo 3, Bindo 7
• Tikkurila Euro 3, Euro 7

Матовые: 

• Dulux Classic Colour
• Tikkurila Euro Trend

Полуглянцевые: 

Глянцевая краска

Окрашивание гипсовых 3d панелей глянцевой краской сопряжено с дополнительными трудностями, но при должном подходе не доставит хлопот. Благодаря чему отражение на рельефе панелей даст возможность заиграть панно из гипсовых панелей заиграть красками и тенями, от различных источников света. Для получения качественного глянцевого покрытия перед окрашиванием необходимо произвести грунтование, и если для матовой краски достаточно обычной акриловой грунтовки. То для глянцевой краски необходим специализированный грунт. 

Грунтовочные краски:

Глянцевые краски:

Шелковистая краска

Шелковистая краска для гипсовых 3d панелей для стен, так которую ещё называют краска с эффектом шёлка. Даёт на поверхности приятное тактильное покрытие с эффектом шёлка. Так же как и многие другие краски может быть заколеровано в необходимый для потребителя цвет. 

Влагозащитная краска 

Влагозащитная краска для гипсовых 3d панелей для стен применяется в случаях когда монтаж панелей предполагается во влажных помещениях. Туалетных комнатах, зоны бассейнов, спа и.т.д. Стоит отметить что, в этом случае гипсовые панели должны быть изготовлены во влагостойком варианте. При этом влагостойкими можно сделать любые рельефы гипсовых панелей GkerStudio. 

Перламутровая краска 

Окрашивание краской с перламутровым эффектом не представляет трудностей. При этом перламутр можно как добавлять например в матовую краску, так и использовать самостоятельно. 

Метализированная краска 

Для окрашивания под различные типы металликов, как хром, тёмный металл, аллюминий, а так же в цвета жёлтых металлов латунь, бронза. Используются специальные красители, в большинстве случаев это наполнители в виде пудры, но лучше использовать готовую краску. 

Возможные проблемы при окрашивании гипсовых панелей

3-D окрашивание | Блог Прелесть Professional

Естественность всегда была в моде, и не только потому что натурального цвета волос было очень тяжело добиться. Долгое время процесс окрашивания волос считался вредным, как и любое химическое воздействие. Сегодня бьюти-индустрия шагнула далеко вперёд, предлагая девушкам кардинально изменить образ и экспериментировать с внешностью, прибегая к 3д окрашиванию. Что представляет собой такая процедура, каков её результат и в чём её преимущества и недостатки? Разберёмся в статье.

Особенности 3-D окрашивания

Новая технология 3д окрашивания – это:

• Оригинальный метод нанесения краски;
• Использование нескольких смежных оттенков и грамотное сочетание их между собой.

Процедура 3д окрашивания позволяет сохранить натуральный цвет волос, при этом создать эффект мелирования и плавного перехода оттенков. Естественный цвет при таком окрашивании выглядит более объёмно, ярко и интересно.

Хотя 3-D окрашивание и напоминает калорирование или мелирование, но отличается от этих процедур одним важным аспектом: выбранные тона относятся к одному цвету. Именно это обуславливает плавный переход оттенков и достижение визуального объёма.

Преимущества и недостатки 3-D окрашивания

Положительные стороны процедуры 3д окрашивания привлекают всё большее количество дам, готовых изменить образ, но не предать идею натуральности. Рассмотрим основные достоинства:

• 3-D окрашивание кардинально не меняет цветовую гамму;
• Волосы становятся более ухоженными и сильными;
• Процедура сделает облик более женственным и необычным;
• Техника предполагает нанесение краски по зонам, позволяя выделять участки стрижки;
• Подходит для частого обновления, не несёт сильного вреда для волос.

Но и стоит сохранять объективность: процедура 3-D окрашивания имеет свои не совсем выгодные стороны. В частности:

• Сложность процесса. 3-D окрашивание не предполагает самостоятельного проведения процедуры (в любом случае придётся обратиться к мастеру).
• Поскольку 3д окрашивание – дело рук профессионалов, важно грамотно подобрать оттенки, которые бы не контрастировали с естественным цветом волос, а только подчёркивали его. Это очень скрупулёзная процедура.
• Новизна процедуры – не во всех салонах красоты можно сделать её. Это объясняется и высокой стоимостью.
• Соблюдение правил по уходу за окрашенными волосами. Должный уход поможет продлить эффект 3-D окрашивания, сохранить блеск и глянцевый перелив локонов. Не каждой косметике для волос по силам поддерживать эффект процедуры 3д окрашивания. Профессиональные средства по уходу за волосами от бренда Прелесть Professional обеспечат интенсивное питание окрашенных волос без потери цвета и блеска.

Что необходимо для процедуры 3-D окрашивания?

Чтобы провести процедуру 3д окрашивания грамотно и комплексно, мастеру понадобятся:

1. Краска 3-5 оттенков высокого качества. Средства должны быть одного производителя.
2. Резиновые перчатки.
3. Фартук или спецодежда, которые защитят кожу от попадания краски во время процедуры.
4. Целлофан или фольга для разграничения прядей.
5. Несколько пластиковых ёмкостей для приготовления смеси.
6. Кисти шириной 3 см для нанесения краски на пряди.
7. Зажимы для волос.
8. Мерный стакан.

Само 3-D окрашивание охватывает несколько этапов: покраска базовым оттенком затылочной области, покраска каждой пряди со стороны затылка цветом посветлее, постепенное осветление прядей в нижней части затылка. Каждую окрашенную прядь заворачивают в полосу фольги, чтобы не смешать цвета. Зона темени окрашивается от границы затылочной области (натуральный цвет) до лобной части (более светлые оттенки).

Рекомендации по покраске 3D моделей (PLA, ABS, PETG, NYLON)

Несмотря на экструдеры, которые способны работать с разными материалами и потрясающее разнообразие цветов пластиков для 3D печати, вы все равно рано или поздно захотите разукрасить некоторые из своих 3D моделей. Самая распространенная причина — улучшить внешний 3D модели, особенно если вы печатаете на FDM 3D принтере, где модель формируется постепенным наслаиванием материала. Именно FDM 3D принтеры формируют модель с характерными линиями вдоль оси Z.

При окончательной отделке 3D модели небольшие полости между слоями шлифуются, заполняются или и то, и другое. Результат — более гладкая поверхность. Покраска также может помочь защитить модель от окружающей среды.

Эта статья разделена на две части: первая познакомит вас с различными методами покраски 3D модели, а вторая (надеюсь) ответит на все ваши мелкие вопросы о технике раскрашивания и о том, как это лучше всего сделать. Читайте дальше, чтобы разобраться как улучшить свои 3D модели с помощью краски!

Грунт — лучший друг краски

Грунтование напечатанной модели улучшает адгезию краски. При любом способе окраски (кроме окрашивания нейлона) использование грунтовки — хорошая идея. Считается, что спрей-грунтовка — самый простой способ получить хорошие результаты. Процесс использования праймера очень прост:

• Очистите и отшлифуйте вашу 3D модель.
• Грунтовку наносите тонкими ровными слоями.
• Отшлифуйте после нанесения первого и последнего слоев, чтобы поверхность была гладкой.
• Дайте каждому слою высохнуть в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к грунтовке.

Метод 1. Покраска с помощью кисти

Лучше всего подходит для: PLA, ABS, PETG пластиков.

Если вы раскрасите напечатанную на 3D принтере модель кистью, вы однозначно добьетесь эффекта неповторимой «ручной работы».

Сначала попробуйте несколько кистей, потому что легче добиться хорошего результата с помощью удобной кисти. Как правило, достаточно использовать только 1 или 2 разные плоские кисти.

Кисть

• Выберите качественную кисть, достаточно жесткую, чтобы справиться с вязкостью краски, которую вы выбрали для работы.
• Поэкспериментируйте с разными типами щетины и формами ручек, чтобы найти подходящую для вас.
• Приостановите покраску, чтобы очистить кисть, как только краска начнет сохнуть. Естественно, кисть надо чистить после каждого использования. Не стоит оставлять высыхающую краску на щетине кисти.
• Кисть после очистки надо хранить, держа на ручке, а не на щетина.

Краска

Когда дело доходит до рисования кистью, вам лучше использовать акриловые краски.

Процесс покраски

• Очистите и отшлифуйте вашу напечатанную 3D модель.
• Краску наносите тонкими ровными слоями.
• Давайте время просохнуть отдельным слоям.

Метод 2. Покраска аэрозолем

Лучше всего подходит для: PLA, ABS, PETG пластиков.

Если вы хотите разукрасить напечатанную на 3D принтере модель равномерно, используя один цвет, то именно использование аэрозоля даст оптимальный результат.

Баллончик

Некоторые бренды предлагают насадки с разными характеристиками.

Перед использованием встряхивайте баллончик в соотвествии с рекомендациями производителя. Позволит краске выходить более равномерно.

Держите сопло в чистоте. Обычно это достигается путем небольшого распыления перевернутой банки в конце каждого сеанса.

Держите баллончик вдали от открытого огня и храните в прохладном месте. Не забывайте, что это контейнер под высоким давлением!

Краска

При поиске аэрозольной краски вы обнаружите, что существует множество ее разновидностей. Если вы хотите использовать определенный оттенок внимательно ознакамливайтесь с RAL, CMYK и RGB значениями на баллончике.

Процесс покраски

• Очистите и отшлифуйте вашу напечатанную 3D модель.
• Начните распыление, направив струю немного за край объекта, который вы хотите раскрасить.
• Нанесите краску, распыляя на поверхность, которую вы хотите разукрасить, медленными ровными мазками.
• Прекратите распыление, направив струю немного за пределы объекта, который вы хотите покрасить.
• Дайте краске высохнуть.

Метод 3. Жидкий краситель (только нейлон)

Лучше всего подходит для: NYLON пластиков.

Вместо того, чтобы пытаться заставить краску прилипать к поверхности вашей напечатанной на 3D принтере модели из нейлона, рекомендуем вместо этого использовать жидкий краситель. Учтите, что это не будет работать с другими материалами. Хотя PLA гигроскопичен и впитывает некоторое количество воды из окружающей среды, его нельзя окрасить путем впитывания красителя. ABS и PETG тоже не подойдут для данной техники.

Для того, чтобы краска дала хороший выраженный цвет после впитывания, лучше использовать полупрозрачный или белый нейлоновый материал при 3D печати. Можно красить и более темные нейлоновые волокна, но цвет будет гораздо менее выраженным.

Краситель

У вас есть выбор из множества марок красителей, но MatterHackers, например, рекомендует Rit DyeMore. Но в целом, если краситель предназначен для синтетической ткани, то все будет в порядке.

Процесс окрашивания

Поскольку нейлон очень гигроскопичен, он впитывает воду даже на открытом воздухе. Вот почему надо всегда сушить нейлоновый материал перед 3D печатью. Мы рекомендуем красить готовую модель, а не без печати.

Применение

Прочтите инструкции производителя выбранного вами красителя. Если вкратце, то использование красителя — довольно простой метод:

• Очистите вашу 3D модель. При шлифовании помните, что окрашивание не покрывает царапины и следы на поверхности вашей модели. Все будет видно даже после окрашивания.
• Краситель смешать с водой и нагреть в кастрюле.
• Используйте термометр, чтобы отслеживать температуру красителя. Следуйте инструкциям производителя, но поддерживайте температуру ниже температуры теплового отклонения филаментов.
• Прикрепите груз к 3D принту и погрузите его в горшок с краской.
• После окрашивания хорошо промойте его в ванне с прохладной водой.
• Чтобы убедиться, что вы пролучите ожидаемый цвет, стоит сделать несколько тестовых покрасок.

Как определить, схватится ли краска с 3D моделью

Вероятно, наиболее важным фактором, заставляющим краску или жидкость по вашему выбору прилипать к твердой поверхности, является разница в поверхностной энергии между жидкостью и твердым телом. Всегда побеждает тот, у кого больше поверхностное натяжение (поверхностное натяжение имеет свою собственную единицу измерения, называемую динами, или динами на квадратный сантиметр).

Основное правило гласит, что поверхностное натяжение краски должно быть как минимум на 10 единиц ниже, чем у твердого материала для хорошей адгезии. Это означает, что у нас есть жидкость с высокой способностью смачивать твердое тело, и нам нужно смачивание.

Чтобы получить представление о том, насколько хорошо смачивается окрашиваемая поверхность, обратите внимание на форму капли жидкости на твердой поверхности:

• Нанесите каплю краски или жидкости на поверхность 3D модели, которую хотите обработать.
• Если жидкость образует шар, у нее слишком большое поверхностное натяжение, чтобы эффективно смачивать объект, и твердое тело не сможет «втянуть» жидкость на себя.
• Если жидкость растекается по поверхности, образуя нечто вроде линзы, смачивание лучше.

Можно ли покрасить 3D модель из любого материала?

Покраска 3D моделей из PLA и ABS пластиков — довольно несложная задача.

С PETG могут возникнуть проблемы в плане долговечности покраски, но применяются те же методики, что и для PLA и ABS. Но если вам действительно нужен насыщенный яркий цвет, то лучше напечатать вашу 3D модель PETG в желаемом цвете и оставить все как есть.

Когда речь заходит о нейлоне, который используется для 3D печати, надо помнить, что краска схватывается хуже. В целом, можно рисовать акриловыми красками и на нейлоне, но это потребует некоторой термической обработки, чтобы максимизировать поверхностное натяжение и дать краске возможность намокнуть. Часто это делается с помощью открытого пламени или плазмы… В общем, в домашних условиях это выглядит непросто, так что лучше использовать красители.

Планирование перед 3D печатью

Для того, чтобы облегчить процесс чистовой обработки и покраски, перед 3D печатью вашей модели рекомендуем учесть следующее:

• Более низкое разрешение 3D печати экономит время при печати, но увеличивает время обработки.
• Учитывайте геометрию вашей модели. Ваши инструменты должны достать до того места, где вы хотите шлифовать или красить.
• Нужны ли мельчайшие детали шлифовки, грунтовки или и того и другого? Если да, могут ли они справиться с этим, не сломавшись?
• Если точность размеров важна для некоторых частей вашей 3D модели, вам, возможно, придется принять это во внимание при моделировании. Добавьте материал, который нужно отшлифовать до нужных размеров, или уменьшите размеры, чтобы освободить место для грунтовки и краски.
• Грунтовка и краска добавляют толщину и могут полностью скрыть мелкие детали вашей модели.
• Шлифовка удаляет материал и делает вашу 3D модель менее прочной.

Пункты для улучшения адгезии краски

И напоследок несколько простых шагов для улучшения адгезии краски:

• При работе с напечатанной 3D моделью надевайте чистые перчатки, чтобы защитить кожу от химикатов, а поверхность модели — от кожного жира.
• Перед шлифовкой удалите загрязнения, вы же не хотите, чтобы грязь попала в вашу модель. Часто для этого хорошо подходит изопропиловый спирт (медицинский спирт) на мягкой безворсовой тряпке.
• Используйте обычный пылесос с мягкой и чистой щеткой для удаления частиц после шлифовки.
• Отшлифуйте все шероховатости, которые добавились во время грунтовки.
• Всегда тестируйте химические вещества, такие как краска, чистящие растворители, шлифовка или другие материалы и варианты обработки, прежде чем переходить к конечной модели, которую вы хотите облагородить.

3D окрашивание » Парикмахерское исскуство

Модные тенденции окрашивания и причёсок для волос готовы предложить нашим женщинам тысячи вариантов: стильных, неординарных, воистину завораживающих взгляд.
Один из наиболее модных способов – это модная технология колорирования или 3D окрашивание волос.

Способы окрашивания в технике 3D

Художественный беспорядок в виде создания визуального объёма – это и есть довольно оригинальное окрашивание 3D, настоящий и сложный вариант изменения цвета волос.
Уникальная и абсолютно творческая техника, которой владеют только опытные парикмахеры–колористы. По причине того, что результат данного вида окраски полностью зависит от художественного виденья и наличия опыта мастера, следует обращаться для окрашивания в салон красоты, где персональный парикмахер сумеет претворить все ваши эстетические желания в жизнь. Всего способов нанесения красителя на волосы два, поэтому рассмотрим каждый из них поподробнее.

3D окраска: сложные пассы умелых рук

Основывается эта техника на сложном комбинировании цветов схожих по палитре, но разных по тональности.
При таком сочетании оттенков достигается эффект трёхмерности окраски волос, что содержит множество плюсов:

– придание визуального дополнительного объёма волосам;
– создание динамики цвета в волосах и неожиданных бликов;
– возможность выделения основных зон стрижки для лучшего эффекта;
– подчёркивание отдельных прядей волос.

Создание подходящей окраски в технике 3D происходит с учётом стрижки, исходного цвета волос и типа внешности клиента.
После выяснения этих аспектов проектируется схема окрашивания, подходящая исключительно к одному данному типу.

Каждая схема является оригинальной и неповторимой, а в связи с этим окраска 3D стоит дороже всех существующих видов изменения цвета волос.

Для данной технологии окрашивания волос применяются стойкие (перманентные) красители по той причине, что обновить данную процедуру при вымывании красителя будет крайне сложно из–за специфики выборки прядей волос. При создании схемы для определения зон окрашивания рисуется подробный эскиз, на котором схематично изображаются зоны, где размечаются пряди, ширина которых не более четырёх миллиметров.
Каждая из зон имеет определённые оттенки красителя, именно они и будут создавать эффект 3D с помощью вибрации схожих между собой тонов красителя.

Инструмент и материалы для выполнения:

Красители (перманентные и схожие по тональности одного цвета).
Одноразовые защитные пеньюар, перчатки, фартук.
Не металлические мисочки, кисточки шириной 2–3 см.
Пластиковые зажимы.
Фольга или целлофановые полоски, сквозь них видно оттенок красителя и проще ориентироваться в нанесении.

Если необходима стрижка волос, то она выполняется непосредственно перед покраской. Это связано с тем, что краситель наносится с учётом особенностей положения и длины волос.
После стрижки производится укладка волос по форме причёски. Краситель наносится на сухие волосы, предварительно разделённые на необходимые по схеме зоны.

Техника 3D окрашивания (первый способ):

Надевается защитная одноразовая одежда (пеньюар, фартук).
Волосы делятся на зоны (блоки) в соответствии с составленной схемой.
Подготавливаются красители.
Красители наносятся поэтапно на каждую зону, начиная с верхних прядей, далее продвигаясь вниз к краевой линии роста волос.
По истечении времени выдержки красителя, фольга или целлофановые полоски снимаются и производится мытьё волос без применения шампуня, но с использованием бальзама для волос.
Производится укладка волос феном и уже на сухой причёске проверяется эффект окраски волос. В случае недостаточной игры цвета мастер может подкорректировать вибрацию оттенков, немного переделав некоторые из элементов стрижки.

Второй способ окрашивания по технологии 3D

Существует и второй способ окраски в технике 3D, он более простой и создает похожий эффект, но не является личным творческим достоянием мастера–колориста.
Такой способ производится с помощью разнопрядного
(от 2 миллиметров до 4) мелирования по всем волосам и последующей окраски в один тон.
Инструмент и материалы для выполнения те, что и при первом способе.

Технология окрашивания:

Надевается защитная одноразовая одежда (пеньюар, фартук).
По всем волосам любой техникой выбирается способ мелирования: шахматный порядок, штопка, зиг–заг.
После полного осветления волос производится мытьё с использованием шампуня и без применения бальзама.
Волосы высушиваются полотенцем.
На слегка влажные волосы наносится перманентный краситель желаемого цвета. Время выдержки не более 30 минут.
После этого производится мытьё волос без применения шампуня и с использованием бальзама для волос.

Оба способа окрашивания в технике 3D дают возможность придать глубину стрижке и позволяют избавиться от эффекта парика при окраске шевелюры в один тон.
Такой способ изменения цвета волос полностью раскрывает возможность красителей и задумку колориста, создавая эффект бликов света на волосах и придавая причёске лёгкость и объём.

Мы стараемся для Вас!

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
  Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
  Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться у системного администратора.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

ch260004589p

% PDF-1.4
%
47 0 объект
>
эндобдж
49 0 объект
> поток
2000-08-07T20: 45: 58ZParlance Publisher 5.0 / (Xyvision Postscript Formatter) 3.0 32021-04-22T10: 51: 43-07: 002021-04-22T10: 51: 43-07: 00 Acrobat Distiller Command 3.02b для Solaris 2.3 и более поздние (SPARC) приложение / pdf

uuid: 02698c38-1dd2-11b2-0a00-9a0827bd7700uuid: 02698c3d-1dd2-11b2-0a00-

0000000
конечный поток
эндобдж
10 0 obj
>
эндобдж
1 0 объект
> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Type / Page >>
эндобдж
12 0 объект
> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] / XObject >>> / Type / Page >>
эндобдж
17 0 объект
> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Type / Page >>
эндобдж
21 0 объект
> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Type / Page >>
эндобдж
26 0 объект
> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Type / Page >>
эндобдж
30 0 объект
> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] / XObject >>> / Type / Page >>
эндобдж
33 0 объект
> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Type / Page >>
эндобдж
50 0 объект
> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Type / Page >>
эндобдж
73 0 объект
[79 0 R 80 0 R 81 0 R 82 0 R 83 0 R 84 0 R 85 0 R]
эндобдж
74 0 объект
> поток
q
540.0594177 0 0 68.6011963 31.4702911 666.3988037 см
/ Im0 Do
Q
BT
/ T1_0 1 Тс
10 0 0 10 85,56989 549,99982 тм
(2000; 60: 4589-4595.) Tj
/ T1_1 1 Тс
-5.55699 0 Тд
(Рак Res \ 240) Tj
/ T1_0 1 Тс
0 1 ТД
(\ 240) Tj
0 1.00001 TD
(Луиза Ю. Фонг, Ву Т. Нгуен, Джон Л. Фарбер и др.)
/ T1_2 1 Тс
0 1 ТД
(\ 240) Tj
/ T1_3 1 Тс
18 0 0 18 30 589,99994 тм
(Опухоль пищевода у крыс с дефицитом цинка) Tj
Т *
(Путь киназы 4-ретинобластомы в клеточной пролиферации) Tj
16.39393 1 тд
(-Циклин D1 / циклин-зависимый) Tj
0.33333 ЦС -2,55699 0 Тд
(ink4a) Tj
0 Ц-13,83694 0 Тд
(Раннее дерегулирование p16) Tj
ET
30 495 543 35 рэ
0 0 мес.
S
BT
/ T1_0 1 Тс
11 0 0 11 120.94202 502.99997 тм
(\ 240) Tj
/ T1_3 1 Тс
-7,55696 1 тд
(Обновленная версия) Tj
ET
BT
/ T1_2 1 Тс
10 0 0 10 141 494,99994 тм
(\ 240) Tj
/ T1_0 1 Тс
23.17896 1 тд
() Tj
0 0 1 рг
-23.17896 0 тд
(http://cancerres.aacrjournals.org/content/60/16/4589)Tj
0 г
0 1.00001 TD
(См. Самую последнюю версию этой статьи по адресу:) Tj
ET
BT
/ T1_2 1 Тс
10 0 0 10 30 474,99997 тм
(\ 240) Tj
0 1 ТД
(\ 240) Tj
ET
BT
/ T1_2 1 Тс
10 0 0 10 30 454.99997 Тм
(\ 240) Tj
Т *
(\ 240) Tj
ET
30 385 543 70 рэ
0 0 мес.
S
BT
/ T1_0 1 Тс
11 0 0 11 120.94202 422.99997 тм
(\ 240) Tj
/ T1_3 1 Тс
-6.00198 1 тд
(Цитированные статьи) Tj
ET
BT
/ T1_2 1 Тс
10 0 0 10 141 414,99994 тм
(\ 240) Tj
/ T1_0 1 Тс
28.

1 тд
() Tj
0 0 1 рг
-28.

0 Тд
(http://cancerres.aacrjournals.org/content/60/16/4589.full#ref-list-1)Tj
0 г
0 1.00001 TD
(Эта статья цитирует 45 статей, 16 из которых вы можете получить бесплатно по адресу:) Tj
ET
BT
/ T1_0 1 Тс
11 0 0 11 120.94202 392.99997 тм
(\ 240) Tj
/ T1_3 1 Тс
-6.33498 1 тд
(Цитирование статей) Tj
ET
BT
/ T1_2 1 Тс
10 0 0 10 141 384,99994 тм
(\ 240) Tj
/ T1_0 1 Тс
30.29193 1 тд
() Tj
0 0 1 рг
-30.29193 0 Тд
(http://cancerres.aacrjournals.org/content/60/16/4589.full#related-urls)Tj
0 г
Т *
(Эта статья процитирована в 10 статьях, размещенных на HighWire. Откройте страницу a \
статьи по адресу:) Tj
ET
BT
/ T1_2 1 Тс
10 0 0 10 30 364,99997 тм
(\ 240) Tj
0 1 ТД
(\ 240) Tj
ET
30 250 543 115 рэ
0 0 мес.
S
BT
/ T1_0 1 Тс
11 0 0 11 120.94202 332.99997 тм
(\ 240) Tj
/ T1_3 1 Тс
-5.66901 1 тд
(Оповещения по электронной почте) Tj
ET
BT
/ T1_0 1 Тс
10 0 0 10 295.49969 345 тм
(относится к этой статье или журналу.) Tj
0 0 1 рг
-15.44997 0 Тд
(Зарегистрируйтесь, чтобы получать бесплатные уведомления по электронной почте) Tj
ET
BT
0 г
/ T1_0 1 Тс
11 0 0 11 120,94202 299,99994 тм
(\ 240) Tj
/ T1_3 1 Тс
-6.38997 1 тд
(Подписки) Tj
0,556 1,00001 тд
(Отпечатки и) Tj
ET
BT
/ T1_0 1 Тс
10 0 0 10 141 302,99994 тм
(\ 240) Tj
13.46497 1 тд
(.) Tj
0 0 1 рг
-6.85098 0 Тд
([email protected]) Tj
0 г
-6.61399 0 Тд
(Отделение) Tj
0 1.00001 TD
(Чтобы заказать перепечатку статьи или подписаться на журнал, свяжитесь с нами \
t Публикации AACR) Tj
ET
BT
/ T1_0 1 Тс
11 0 0 11 120.94202 277,99997 тм
(\ 240) Tj
/ T1_3 1 Тс
-5.66901 1 тд
(Разрешения) Tj
ET
BT
/ T1_0 1 Тс
10 0 0 10 141 249,99988 тм
(\ 240) Tj
0 1 ТД
(Сайт Rightlink.) Tj
0 1.00001 TD
(Нажмите «Запросить разрешения», чтобы перейти на страницу защиты авторских прав \
Центр Рэнсиса \ (CCC \)) Tj
23.17896 1 тд
(.) Tj
0 0 1 рг
-23.17896 0 тд
(http://cancerres.aacrjournals.org/content/60/16/4589)Tj
0 г
0 1 ТД
(Чтобы запросить разрешение на повторное использование всей или части этой статьи, используйте это li \
nk) Tj
ET
BT
/ T1_0 1 Тс
9 0 0 9 278,74257 1.\ q

Какие анализы кала проводятся при обследовании на криптоспоридиоз?

Крупномасштабное внутреннее валидационное исследование технологий неконтролируемого виртуального окрашивания трихромом на биопсиях печени при неалкогольном стеатогепатите

Набор для окрашивания расщепленным каспазом-3 (красный) (ab65617)

Обзор

• Название продукта

• Тип образца

  Адгезивные клетки, суспензионные клетки

• Тип анализа

  Активность фермента

• Время анализа

  2 ч.
  00м

• Обзор продукции

  Набор для окрашивания расщепленной каспазой-3

  (красный) ab65617 обеспечивает удобное средство для обнаружения активированной каспазы-3 в живых клетках.В анализе используется ингибитор каспазы-3 DEVD-FMK, конъюгированный с сульфорамином (Red-DEVD-FMK), в качестве флуоресцентного маркера in situ. Red-DEVD-FMK проницаема для клеток, нетоксична и необратимо связывается с активированной каспазой-3 в апоптических клетках.

• Банкноты

  Ранее назывался Caspase-3 (active) Red Staining Kit.

• Платформа

  Считыватель микропланшетов, Fluor.микроскоп, Flow cyt.

Недвижимость

• Инструкции по хранению

  Хранить при -20 ° C. См. Протоколы.

• Компоненты	100 тестов
  Красный-DEVD-FMK	1 x 100 мкл
  Промывочный буфер	2 x 100 мл
  Z-VAD-FMK	1 x 10 мкл

• Направления исследований

• Актуальность

  Цистеиновые протеазы семейства каспаз играют ключевую роль в апоптозе.Каспаза 3 (также известная как CPP32, YAMA и апопаин) является наиболее изученным апоптотическим белком среди членов семейства каспаз. Каспаза 3 синтезируется как неактивный профермент, который процессируется в клетках, подвергающихся апоптозу, путем самопротеолиза и / или расщепления другими вышестоящими протеазами (например, каспазами 8, 9 и 10).
  Процессированная форма каспазы 3 состоит из больших (17 кДа) и малых (12 кДа) субъединиц, которые связываются с образованием активного фермента. Каспаза 3 расщепляется по Asp28 — Ser29 и Asp175 — Ser176.Активная каспаза 3 протеолитически расщепляет и активирует другие каспазы (например, каспазы 6, 7 и 9), а также соответствующие мишени в клетках (например, PARP и DFF). Альтернативный сплайсинг этого гена приводит к двум вариантам транскрипта, кодирующим один и тот же белок.
  В иммуногистохимических исследованиях было показано, что экспрессия каспазы 3 широко распространена, но присутствует не во всех типах клеток (например, обычно сообщается в эпителиальных клетках кожи, проксимальных канальцах почек и собирательных протоках). О различиях в уровне каспазы 3 сообщалось в клетках короткоживущей природы (например, В-клетки зародышевого центра) и в клетках долгоживущих (например,грамм. В-клетки мантийной зоны).
  Каспаза 3 является преобладающей каспазой, участвующей в расщеплении белка-предшественника бета-амилоида 4A, что связано с гибелью нейронов при болезни Альцгеймера.

• Сотовая локализация

  Цитоплазматический

• Альтернативные названия

  • A830040C14Rik
  • Апопейн
  • Предшественник апопаина
  • CASP 3
  • CASP-3
  • CASP3
  • CASP3_HUMAN
  • Casp3a
  • Цистеиновая протеаза, связанная с апоптозом каспазы 3
  • Субъединица p12 каспазы 3
  • Caspase 3 p17 субъединица
  • Каспаза 3, цистеинпептидаза, связанная с апоптозом
  • Каспаза 3, цистеиновая протеаза, связанная с апоптозом
  • Каспаза 3, цистеиновая протеаза, связанная с апоптозом
  • Субъединица каспазы-3 p12
  • Caspase3
  • CC3
  • CP32B
  • CPP 32
  • CPP-32
  • CPP32
  • CPP32B
  • Цистеиновая протеаза CPP32
  • EC 3.4.22.56
  • ДВС 3
  • Вши
  • млды
  • OTTHUMP00000165052
  • OTTHUMP00000165053
  • OTTHUMP00000165054
  • Протеаза расщепления PARP
  • Procaspase3
  • Протеин Яма
  • SCA 1
  • SCA-1
  • SCA1
  • Активность расщепления SREBP 1
  • Яма
  • Яма протеин

  посмотреть все

Изображения

• Функциональные анализы: Caspase-3 (active) Red Staining Kit (ab65617)

  Активность каспазы-3 в клетках Jurkat (3 клетки x10e5) после 24-часового воздействия 2 мкМ камптотецина (ab120115) с 50 мкМ ингибитора каспазы Z-VAD (OMe) -FMK (ab120487) или без него.Фоновый сигнал вычитается, дублируется; +/- SD.

Листы данных и документы

• SDS скачать
  

  Страна / регион Выберите страну / регион

  Язык Выбор языка

• Скачать брошюру
  

Список литературы (0)

ab65617 еще не упоминался в каких-либо публикациях.

Отзывы и вопросы клиентов

МАЛЬМ Каркас кровати, высокий, дубовый шпон, беленый, Queen

Я люблю это Саманта Идеально. У него хорошая высота, и мне нравится цвет. Было сложно собрать, но через некоторое время я получил его.5

Очень понравилось! Просто поставить Дэвид Обожаю! Просто собрать5

прочная, но сложная сборка Джули С. Практически все, что я купил в ИКЕА, было очень легко собрать… кроме этой кровати. Это было более сложной задачей, чем я ожидал. Тем не менее моей дочери очень нравится! 4

Достойно по цене. WishIesha Достойный по цене. Хотелось бы, чтобы планки были более прочными. К вашему сведению, я выбираю меньшую сторону для вашего матраса, так как он может не подходить совсем правильно.4

Полноразмерная кроватьIllonaGreat bed5

Отличная цена Отличная кроватьРоланда Отличная кровать за свои деньги. Легко собрать и легко понять направления. Я купил полный комплект спальни Мальм. Мне это очень нравится5

Всегда люблю IkeaJOEStrong bed5

Отличное соотношение цены и качестваHazel Отличная кровать по цене5

Отличное качество по хорошей ценеJennieeasy собрать с нетерпением жду ящиков для нижней части5

Очень доволен своим выбором! OmilaniaОчень доволен своим выбором! ! 5

Великолепный каркас кроватиМишельЭто действительно хороший каркас кровати по такой цене.Прекрасно сочетается с другими серыми элементами в спальне, и мне нравится, насколько высоко стоит кровать над землей.5

SturdyDAMON Инструкциям было легко следовать. Эта кровать прочная и красивая.5

Beautiful BedframeThana Я изначально хотел, чтобы она была черного цвета, но серый идеально подходит. Не самый простой в сборке, но в любом случае несложный. У меня есть подходящие прикроватные столики, и я им очень доволен.5

Дочь очень любит, Рэнди Дочь очень любит 5

Идеальная кроватьSonya Идеально для моего сына.У него небольшая комната, и у нас есть 2 ящика для хранения вещей под ней. Идеально, и ему это нравится.5

Это отличный каркас кровати, КРИСТЕН Это отличный каркас кровати, изголовье немного скрипит в целом отличный продукт5

Мальм на победуLatesa Я купил эту кровать для своего сына-подростка. Его предыдущая кровать была двухместной над полноценной двухъярусной кроватью, и он хотел чего-то более взрослого. Нужно было собрать много кусочков, но конечный результат был прекрасен. Кровать твердая. Красивая отделка шпоном дерева, которую легко чистить.И это совсем не похоже на прежнюю металлическую кровать, которая пищала каждый раз, когда он двигался во время сна. Он сочетается с его комодом в Мальме, что придает его комнате взрослый вид, который он хотел, без ущерба для моего банка. Love it.5

Великолепный простой стильMAXЭту кровать легко установить, и она отлично выглядит. У него замечательный чистый и простой стиль.5

Отличный и доступныйМелисса Я обожаю товар марки ikea !! Простота сборки и отличные цены !! 5

Простая сборка Качество ProductJamesЭту кровать легко собрать, и она выглядит прочной в собранном виде.Готовый продукт привлекателен, и то, что я предполагал5

Анализ отдельных клеток выявляет множественные потребности в цинке в клеточном цикле млекопитающих

Введение

Цинк (Zn ²⁺ ) является вторым по распространенности переходным металлом в биологии и широко известен как незаменимый микронутриент для всех живых организмов (1). Zn ²⁺ был впервые зарегистрирован как необходимый для роста Aspergillus niger в 1869 году и впоследствии продемонстрирован на растениях, животных и людях (2) с первыми случаями дефицита Zn ²⁺ у человека и связанного с ним роста и роста. нарушения развития, описанные в 1961 г. (3).Дефицит Zn ²⁺ с тех пор был признан глобальной проблемой здравоохранения, и, по оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ошеломляющая треть населения мира не потребляет в достаточном количестве Zn ²⁺ и, следовательно, подвержена риску для связанной стороны эффекты и сопутствующие заболевания (https://www.who.int/whr/2002/chapter4/en/index3.html) (4). Хотя клинические проявления дефицита Zn ²⁺ разнообразны и могут быть специфичными для организма, одна определяющая особенность является универсальной: клетки с дефицитом Zn ²⁺ не могут нормально делиться и размножаться, что приводит к нарушению роста организма (5).Несмотря на признание фундаментальной роли Zn ²⁺ для пролиферации, механизмы того, как дефицит Zn ²⁺ приводит к остановке клеточного цикла на клеточном и молекулярном уровне, остаются плохо определенными.

Пролиферация эукариотических клеток регулируется циклом клеточного деления, серией тщательно спланированных шагов, которые включают фазы разрыва (G1), репликации ДНК (S-фаза), промежутка (G2) и митоза (M). Регулируемые переходы между пролиферативным и спокойным (то есть обратимыми непролиферативными) состояниями важны для поддержания целостности генома и гомеостаза тканей, обеспечения правильного развития и предотвращения туморогенеза.Учитывая важность Zn ²⁺ для роста и пролиферации, фундаментальный вопрос заключается в том, служит ли Zn ²⁺ питательным веществом, как и аминокислоты, влияет ли он на скорость развития клеточного цикла или требуется специфическая фаза клеточного цикла. Новаторская работа Chesters et al. Стремилась точно определить, когда Zn ²⁺ необходим в клеточном цикле млекопитающих. Хелатируя Zn ²⁺ в разные моменты времени после выхода из состояния покоя, вызванного сывороточным голоданием, они обнаружили, что Zn ²⁺ важен для включения тимидина и, следовательно, синтеза ДНК, что привело к выводу, что Zn ²⁺ необходим для переход G1 в S (6).Последующие исследования подтвердили, что обработка клеток млекопитающих высокими концентрациями хелаторов металлов (DTPA и EDTA), по-видимому, нарушает синтез ДНК (7-10). Однако более поздние исследования Честерс и др. Показали, что после того, как клетки прошли точку рестрикции в середине G1, больше не требовалось Zn ²⁺ для синтеза ДНК в S-фазе, а для перехода из G2 требовался Zn ²⁺ . / M обратно в G1 (11). Точка рестрикции классически определяется как точка, в которой клетки совершают завершение клеточного цикла, несмотря на присутствие митогенов и / или сыворотки (12).Таким образом, хотя эти ранние исследования показали, что Zn ²⁺ важен для развития клеточного цикла млекопитающих, точная роль Zn ²⁺ и то, требуется ли он на определенной стадии, остаются загадочными.

Есть три ограничения этих ранних исследований роли Zn ²⁺ в пролиферации клеток. Во-первых, поскольку анализы проводились на популяциях клеток, клетки были синхронизированы с помощью искусственных средств (сывороточное голодание или обработка гидроксимочевиной), и фаза клеточного цикла определялась на основании высвобождения из блока клеточного цикла.Недавно стало ясно, что синхронизация может вызывать пути реакции на стресс, специфичные для типа остановки (13, 14). Кроме того, клетки, индуцированные в состояние покоя с помощью различных механизмов (сывороточное голодание, потеря адгезии, контактное ингибирование), демонстрируют перекрывающиеся, но различные профили транскрипции, предполагая, что разные подходы к синхронизации влияют на анализ клеточного цикла при выходе из состояния покоя (15). Во-вторых, анализы на уровне популяции, такие как иммуноблоттинг и кПЦР, маскируют клеточную гетерогенность и субпопуляции клеток с различными клеточными судьбами и динамикой клеточного цикла (14, 16).Недавнее применение инструментов визуализации и измерения для анализа отдельных клеток позволило выявить отдельные субпопуляции клеток с различной динамикой клеточного цикла (16) и выявить ключевые порядки молекулярных событий при выборе между пролиферацией и покоем (16-19). В-третьих, многие из предыдущих исследований роли Zn ²⁺ в клеточном цикле млекопитающих основывались на высоких концентрациях хелаторов (DTPA, EDTA или TPEN) для индукции дефицита Zn ²⁺ . Однако в этих исследованиях не было явного определения того, как эти нарушения изменяют внутриклеточный лабильный пул Zn ²⁺ , и не было охарактеризовано, как хелаторы влияют на жизнеспособность клеток.Действительно, было показано, что используемые концентрации хелаторов вызывают апоптоз в ряде различных типов клеток (20–30).

В этом исследовании мы возвращаемся к фундаментальному и нерешенному вопросу о том, как дефицит Zn ²⁺ блокирует пролиферацию клеток с использованием комбинации флуоресцентных репортеров, высокопроизводительной микроскопии и количественного анализа изображений. Часто упускается из виду, что сыворотка не только служит резервуаром для митогенов, но и является основным источником основных питательных микроэлементов, включая Zn ²⁺ , Fe ²⁺ и Mn ²⁺ , и, таким образом, полное удаление сыворотки. также устраняет поступление этих и других важных питательных веществ извне.Контролируя Zn ²⁺ в среде, поддерживая митогены на уровнях, которые обычно поддерживают пролиферацию, мы индуцировали тонкие нарушения лабильного Zn ²⁺ в цитозоле от 1 до 210 пМ и отслеживали асинхронно циклические клетки в течение нескольких раундов деление клеток. Мы обнаружили, что дефицит Zn ²⁺ вызывает покой клеток, но не гибель, а пополнение запасов Zn ²⁺ стимулирует синхронизированный повторный вход в клеточный цикл. Наблюдая за переходом отдельных клеток в состояние покоя с течением времени после депривации Zn ²⁺ , мы обнаружили, что в зависимости от того, где клетки находились в клеточном цикле, они либо переходили в состояние покоя после митоза, либо входили в клеточный цикл, но останавливались в S-фазе.Кроме того, мы определили, что клетки, остановившиеся в S-фазе, были дефектными в синтезе ДНК и имели повышенные уровни повреждения ДНК, что согласуется с предыдущими исследованиями массового анализа (31–33), предполагающими критическую роль Zn ²⁺ в поддержании целостности генома во время репликации. . Наконец, мы обнаружили, что для покоя, вызванного дефицитом Zn ²⁺ , не требуется p21, что указывает на механизм, отличный от спонтанного покоя (16, 19), и следует другой модели, нежели вывод митогена.В конечном счете, наше исследование дает новое понимание того, когда Zn ²⁺ требуется во время клеточного цикла млекопитающих, и последствия недостаточного уровня Zn ²⁺ .

Результаты

Уровни питательного цинка

²⁺ влияют на пролиферацию клеток и внутриклеточный уровень цинка ²⁺

Чтобы вернуться к вопросу о том, как дефицит цинка ²⁺ блокирует рост и пролиферацию клеток, мы использовали инструменты для визуализации, отслеживания и измерять молекулярные маркеры с использованием флуоресцентных репортеров в естественных циклических клетках на уровне отдельных клеток.Общепризнано, что клетки млекопитающих содержат сотни микромолярных общих Zn ²⁺ (34), которые они способны концентрировать из внеклеточной среды. Концентрация Zn ²⁺ в сыворотке крови человека составляет около 12-15 мкМ (35), а среды для культивирования клеток обычно содержат 1-40 мкМ Zn ²⁺ (36), большая часть которого обеспечивается сывороткой. Чтобы строго контролировать доступность Zn ²⁺ в нашей питательной среде, мы обрабатывали сыворотку и инсулин (основные источники Zn ²⁺ ) Chelex ^® 100 для удаления Zn ²⁺ .Затем мы создали минимальную среду (MM), содержащую низкий процент сыворотки (1,5%), все еще достаточную для пролиферации, которая содержала 1 мкМ Zn ²⁺ , как определено масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS), которая была немного ниже. чем 1,8 мкМ Zn ²⁺ , обнаруженный в средах для полного роста, содержащих 5% сыворотки (дополнительный рисунок S1). Для дальнейшего манипулирования Zn ²⁺ в MM либо добавляли 30 мкМ ZnCl ₂ для создания полной среды Zn ²⁺ (ZR), либо 2-3 мкМ Zn ²⁺ -специфического хелатора, трис ( 2-пиридилметил) амин (TPA) для создания Zn ²⁺ -дефицитной среды (ZD) (37).Чтобы установить влияние этих сред на жизнеспособность клеток, мы выращивали клетки в соответствующих средах в течение 30 часов и измеряли жизнеспособность, используя трипановый синий. Мы также сравнили TPA с N, N, N ‘, N’-тетракис- (2-пиридилметил) этилендиамином (TPEN), другим хелатором Zn ²⁺ , который широко использовался при изучении действия Zn ²⁺ — недостаточность пролиферации клеток (38-40). Даже при низком уровне концентраций TPEN, о котором сообщалось в литературе (3 мкМ), через 24 часа наблюдалась гибель более 70% клеток по сравнению с 3 мкМ TPA с гибелью клеток ~ 15%.Если отмечено, использовалось еще более мягкое условие ZD — 2 мкМ TPA, и это условие привело только к ~ 1% гибели клеток (дополнительный рисунок S2). Наши результаты согласуются с несколькими исследованиями, которые показали, что TPEN вызывает апоптоз (20–30).

Чтобы определить, как определенные условия среды Zn ²⁺ влияют на внутриклеточные лабильные уровни Zn ²⁺ в цитозоле, мы создали клеточную линию MCF10A, стабильно экспрессирующую генетически кодируемый сенсор на основе FRET для Zn ²⁺ (ZapCV2 ( 41)), выращивали клетки в среде ZD, MM и ZR и измеряли соотношение FRET в состоянии покоя в отдельных клетках.Клетки, выращенные в ZD, имели значительно более низкое среднее соотношение FRET, чем клетки, выращенные в MM, в то время как клетки, выращенные в условиях ZR, имели значительно более высокие отношения FRET (рис. 1A). Соотношение FRET коррелирует с количеством лабильного Zn ²⁺ в цитозоле, и калибровка in situ предполагает, что соответствующие уровни Zn ²⁺ составляют приблизительно 1, 80 и 210 пМ для сред ZD, MM и ZR соответственно. (Дополнительная фигура S3), что указывает на то, что экзогенные уровни питательного Zn ²⁺ положительно влияют на внутриклеточные уровни свободного Zn ²⁺ .

Рисунок 1. Питательные уровни цинка ²⁺ влияют на пролиферацию клеток и внутриклеточные уровни цинка ²⁺ .

A) Соотношение FRET, которое пропорционально лабильному Zn ²⁺ , клеток, экспрессирующих ZapCV2 и выращенных в условиях ZD, MM или ZR (n = 103, 382 и 402, соответственно). Буквы обозначают статистически разные группы по ANOVA с Тьюки-Крамером, p <0,001 для каждого сравнения. DF = 2 и F = 333). Средние отношения FRET были рассчитаны за один час до митоза.B) Нормализованное количество клеток после 60 часов роста либо в среде с дефицитом цинка (ZD), либо в среде с минимальным содержанием цинка (MM), либо в среде с высоким содержанием цинка (ZR). Условия ZD / MM и ZD / ZR выращивали в среде ZD до пополнения запасов средой MM или ZR через 24 часа. Каждая линия представляет клетки, выращенные в отдельной лунке (n = 4 на условие). Подсчет клеток нормализовали до исходной плотности в каждой лунке. C) События митоза, обнаруженные с течением времени у клеток на панели A. События митоза были идентифицированы, как описано в дополнительном примечании (общие события митоза объединены из 4 лунок).

Чтобы оценить, как три режима питания Zn ²⁺ влияют на пролиферацию клеток, мы подсчитали клетки как функцию времени. Клетки с естественным циклом, экспрессирующие h3B-mCherry, визуализировали в течение 60 часов, и клетки в каждом кадре сегментировали и подсчитывали с использованием специального автоматизированного анализа, как описано в дополнительном примечании. Условия роста ZD показали значительно уменьшенное количество клеток с течением времени по сравнению с условиями MM и ZR, при этом пролиферация клеток эффективно останавливалась примерно через 15 часов (рис. 1B).Клетки, выращенные в условиях ZR, достигли более высокого количества клеток, демонстрируя, что повышенное содержание Zn ²⁺ в среде способствует клеточной пролиферации.

Установив, что наши условия с дефицитом Zn ²⁺ не привели к повышенной гибели клеток, снижение количества клеток в условиях ZD могло быть результатом либо более длительного времени между делениями клеток, либо увеличения доли клеток, которые попадают в не- пролиферативное спокойное состояние. Чтобы дифференцировать эти возможности, мы отслеживали отдельные клетки во времени и подсчитывали количество событий митоза и время между этими событиями.События митоза идентифицировали по комбинации изменения интенсивности h3B-mCherry и изменения размера ядра, как описано в дополнительном примечании. Количество митозов в среде ZD со временем уменьшалось, и через 15 часов было обнаружено несколько митозов (рис. 1С). Клетки, выращенные в условиях MM и ZR, подвергались митозам в течение всего периода наблюдения со сравнимым межмитотическим временем (пик около 13 часов, дополнительный рисунок S4). Межмитотическое время нельзя было измерить в среде ZD, потому что немногие клетки прошли несколько раундов клеточного деления.Пополнение запасов Zn ²⁺ путем добавления обратно среды MM или ZR через 24 часа в условиях ZD восстановило пролиферацию клеток (фиг. 1B, 1C), показывая, что клетки были компетентными в отношении клеточного цикла. В совокупности эти результаты предполагают, что умеренная депривация Zn ²⁺ снижает пролиферацию клеток не за счет индукции гибели клеток, а за счет индукции остановки клеточного цикла.

Легкий дефицит Zn

²⁺ вызывает клеточное покой и остановку клеточного цикла при промежуточной активности CDK2

Для дальнейшего изучения того, как условия ZD останавливают деление клеток и характеризуют состояние клеток в среде ZD, мы исследовали судьбу отдельных клеток, используя флуоресцентный репортер активности CDK2 (16).После деления клетки активность CDK2 низкая, и флуоресцентный репортер локализован в ядре, но по мере прохождения клеточного цикла активность CDK2 увеличивается, и репортер постепенно перемещается в цитозоль (16). Таким образом, соотношение цитозольной / ядерной флуоресценции можно использовать для считывания активности CDK2 и служит «молекулярным таймером» для прохождения клеточного цикла. Как описано ранее, активность CDK2 определяет субпопуляции клеток с разными клеточными судьбами в популяции естественно циклических клеток (16, 17, 19, 42, 43).Когда соотношение CDK2 остается низким после митоза (CDK2 ^низкий ), клетка классифицируется как покоящаяся, тогда как когда активность CDK2 увеличивается выше определенного порога в течение 4 часов после митоза (CDK2 ^inc ), клетка рождается, преданная клеточному циклу. запись (рис. 2А). Наблюдалась третья классификация, согласно которой клетка рождается с низкой активностью CDK2 (низкое соотношение CDK2), но в конечном итоге усиливает активность и вступает в клеточный цикл (CDK2 ^{появляются} ).

Рис. 2. Легкий дефицит Zn ²⁺ вызывает покой клеток и остановку клеточного цикла в S-фазе.

A) Схема возможных судеб клеток, идентифицированных с использованием репортера активности CDK2. Пунктирные линии указывают время и пороги активности CDK2, используемые для классификации клеточных судеб. Следы клеток были сопоставлены с митозом с помощью вычислений. B) Одноклеточные следы CDK2 клеток, выращенных в течение 60 часов в среде ZD, MM или ZR (n = 80 случайных следов клеток из 4 отдельных лунок). Серые следы CDK2 на верхней панели отображаются в реальном времени, а красные точки указывают на события митоза. Следы CDK2 на нижней панели выровнены с помощью вычислений по митозу и окрашены в соответствии с классификациями клеточных судеб, основанными на активности CDK2 после первого события митоза.Процент общего количества трасс, отнесенных к каждой категории, указан над трассами. C) Следы классификации судьбы отдельных клеток клеток, выращенных в среде ZD, как в B (n = 80 случайных следов). D) FACS-анализ клеток, выращенных в течение 24 часов в среде ZD (3 мкМ или 2 мкМ TPA), MM или ZR. Графики разброса плотности pRb Ser 807/811 против окрашивания ДНК PI отображаются для каждого условия роста (n = 4527, 6104, 7149, 10010 соответственно). Показаны популяции Hyper-pRb по сравнению с hypo-pRb.

Чтобы определить, как доступность Zn ²⁺ в среде влияет на обязательность клеточного цикла, мы использовали клеточную линию MCF10A, стабильно экспрессирующую флуоресцентный репортер CDK2 и h3B-mTurquoise2, и визуализированные клетки в среде ZD, MM или ZR в течение 60 часов.Отдельные клетки были сегментированы, отслежены и проанализированы на активность CDK2 с использованием настраиваемого конвейера MATLAB (дополнительное примечание). В среде, достаточной для Zn ²⁺ , клетки естественным образом циклировались в течение всего окна наблюдения, что подтверждается наблюдением событий митоза, интермитотического времени и циклического снижения активности CDK2 после митоза с последующим повышением приверженности маркировки клеточного цикла (рис. 2В). , Дополнительный рисунок S4). Когда следы клеток от каждого состояния были сопоставлены с помощью вычислений митозу, мы наблюдали все три классификации клеточных судеб (CDK2 ^inc , CDK2 ^Emerge , CDK2 ^low ) с аналогичным процентом в каждой категории в средах MM и ZR (CDK2 ^{). inc} 56% vs.60%, CDK2 ^{появляются} 49% против 41%, CDK2 ^низкие 17% против 14% для MM и ZR соответственно). Однако в среде ZD количество событий митоза прекращалось примерно через 20 часов, активность CDK2 либо оставалась низкой, либо повышалась до промежуточного уровня, а клетки редко подвергались многократным циклам клеточного цикла (рис. 2В). Вычислительное сопоставление с митозом и классификация клеток показали, что немногие клетки родились с активностью CDK2, достаточной для перехода в следующий клеточный цикл (9% CDK2 ^inc ), значительное снижение по сравнению с MM и ZR, и было существенное увеличение процент клеток с низкой активностью CDK2 после митоза CDK2 ^low (41%).Одним из наиболее ярких различий между ZD и условиями MM или ZR была судьба клеток, которые пытались повторно войти в клеточный цикл (т.е. чья активность CDK2 увеличилась) после митоза. Как показано на фиг. 2C, в среде ZD CDK2 ^{появляются клетки} , которые увеличивают активность CDK2 после периода временного покоя, но выходят на плато при промежуточной активности CDK2 (соотношение примерно 1,2), не достигают максимальной активности CDK2 и не могут делиться. Точно так же клетки CDK2 ^inc увеличивали активность CDK2 до среднего уровня, прежде чем они упали до низкого уровня (Рисунок 2C).Анализ событий митоза показал, что эти клетки не делятся до перехода в состояние CDK2 ^low . Эти результаты предполагают значительное увеличение количества клеток, которые переходят в состояние покоя после митоза, и появление новой клеточной судьбы, когда клетки пытаются повторно войти в клеточный цикл, но останавливаются на полпути в условиях дефицита Zn ²⁺ . .

Чтобы дополнительно определить, как дефицит Zn ²⁺ влияет на судьбу клеток и охарактеризовать последствия измененного профиля активности CDK2 в клетках ZD, мы исследовали нижестоящий субстрат CDK2, белок ретинобластомы (Rb).Когда уровни CDK2 низкие, Rb связывается с факторами транскрипции семейства E2F и ингибирует их, блокируя развитие клеточного цикла (44). По мере увеличения активности CDK2 Rb становится гиперфосфорилированным, что снимает ингибирование, позволяя E2F транскрибировать гены клеточного цикла. Предыдущее исследование показало, что клетки, рожденные с повышенной активностью CDK2, также имели гиперфосфорилированный Rb (pRb), как определено с помощью иммунофлуоресценции, тогда как клетки, рожденные с CDK2 ^low , имели низкие уровни фосфорилированного Rb (16). Мы использовали аналогичный протокол для измерения содержания фосфорилированных Rb и ДНК с помощью сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS).После 24 часов роста в среде MM или ZR у большинства клеток был hyper-pRb с содержанием ДНК 2N, промежуточного или 4N, что позволяет предположить, что клетки активно циклически проходят через G1, S, G2 и M (рис. 2D). Небольшая фракция клеток с содержанием ДНК hypo-pRb и 2N соответствует небольшой фракции клеток с CDK2 ^low и представляет собой покоящиеся клетки. Обработка клеток 2 мкМ TPA в течение 24 часов показала, что большинство клеток имели содержание ДНК 2N и гипо-pRb, что согласуется с тем, что большинство клеток находятся в состоянии покоя.Однако некоторые клетки имели гипер-pRb, что указывало на повышенную активность CDK2 и попытку продвижения по клеточному циклу, хотя наблюдалось уменьшение доли клеток с содержанием ДНК 4N, указывающее на недостаточность репликации ДНК. С 3 мкМ TPA большинство клеток имело hypo-pRb с содержанием ДНК 2N, что соответствовало состоянию покоя. Небольшая популяция клеток имела содержание ДНК hypo-pRb и 4N, что позволяет предположить, что после репликации ДНК клетки вошли в состояние покоя, не подвергаясь митозу, что согласуется с популяцией клеток CDK2 ^inc на рисунке 2C, которая возвращается к CDK2 ^low государственный.В совокупности эти результаты показывают, что Zn ²⁺ необходим для прогрессирования клеточного цикла, и существует гетерогенность клеточного ответа на депривацию Zn ²⁺ ; некоторые клетки рождаются с низкой активностью CDK2 и сразу переходят в состояние покоя, в то время как другие рождаются с повышенной активностью CDK2 (CDK2 ^inc ) или повышают активность CDK2 после некоторой задержки (CDK2 ^{появляются} ). Кроме того, наши результаты показывают, что чем слабее дефицит Zn ²⁺ , тем больше клеток пытается пройти через следующий клеточный цикл после митоза.Однако существует четкое требование к Zn ²⁺ для успешного перехода от S-фазы к G2 / M, что мы исследуем ниже.

Время удаления Zn

²⁺ в зависимости от состояния клеточного цикла влияет на клеточную судьбу

Эксперименты на Фигуре 2 выявили гетерогенность в клеточной судьбе в ответ на дефицит Zn ²⁺ . Учитывая, что перед депривацией Zn ²⁺ клетки вращались асинхронно, мы задались вопросом, определялась ли судьба клетки положением клетки в клеточном цикле во время удаления Zn ²⁺ .Чтобы решить эту проблему, мы визуализировали клетки, экспрессирующие сенсор CDK2 в MM в течение 8 часов, чтобы отслеживать развитие клеточного цикла до депривации Zn ²⁺ и следить за переходом клеток в состояние покоя. Мы сгруппировали следы клеток в соответствии с тем, когда клетки разделились в пределах определенных 4-часовых окон относительно добавления TPA (час 0), от 4 часов до добавления TPA (от -4 до 0) до 16 часов после добавления TPA (Рисунок 3A, серые заштрихованные прямоугольники) . Для клеток, которые делились в течение 4 часов до добавления TPA, небольшой, но повышенный процент клеток перешел в состояние покоя (15% vs.7% в MM), предполагая, что клетки нуждаются в Zn ²⁺ при выходе из митоза и переходе в G1. Тем не менее, когда клетки делятся в течение 4 часов после депривации Zn ²⁺ , большинство клеток повторно входят в клеточный цикл либо сразу (CDK2 ^inc ), либо с небольшой задержкой (CDK2 ^{появляются} ). Что было поразительно в этой популяции клеток, так это то, что только небольшая фракция была способна завершить следующий раунд клеточного деления по сравнению с клетками в условиях MM (рис. 3A, верхние 2 панели), и вместо этого большинство клеток остановилось с промежуточным соотношением CDK2.Таким образом, даже если клетки рождаются с повышенной активностью CDK2 и проходят классическую точку ограничения, определяемую потребностью во внеклеточных сигналах роста, таких как митогены (12), они редко проходят мимо промежуточной активности CDK2 в отсутствие Zn ²⁺ . В клетках, которые разделились на последующие промежутки времени после добавления TPA, наблюдалось постепенное уменьшение процента клеток, рожденных с повышенной активностью CDK2 и классифицированных как CDK2 ^inc (43%, 30%, 17% и 5%), это указывает на то, что более длительная депривация Zn ²⁺ увеличивает вероятность перехода клеток в состояние покоя после митоза (рис. 3A сверху вниз).Наблюдалось небольшое увеличение процента покоящихся клеток в невозмущенной ММ с течением времени из-за увеличения плотности клеток и покоя, вызванного контактным ингибированием. Примечательно, что когда Zn ²⁺ был удален до клеточного деления и клетки пытались войти в другой раунд клеточного цикла, они останавливались на промежуточной активности CDK2, что согласуется с неспособностью продвинуться дальше S-фазы в отсутствие Zn ^{. 2+} .

Рисунок 3. Время депривации Zn ²⁺ относительно фазы клеточного цикла влияет на судьбу клетки.

A) Одноклеточные следы соотношения CDK2 с течением времени в клетках, выращенных в течение 8 часов в ММ с последующими 24 часами в условиях ZD (левые панели) или в невозмущенных ММ (правые панели). Стрелка / черная вертикальная полоса указывает время добавления TPA. Следы разделены окнами, показывающими, когда они подверглись событиям митоза относительно добавления TPA. Эти 4-часовые окна заштрихованы серым цветом (от -4 до 0 часов относительно добавления TPA, 0-4, 4-8, 8-12 и 12-16). На каждом графике показано n = 120 случайных трасс (кроме верхнего правого графика: n = 43 из-за меньшего количества клеток, идентифицированных в окне) из 24 лунок для клеток с нарушенным TPA и 8 лунок для клеток MM.% Трасс в каждой категории перечислены под каждым графиком. Количество ячеек, проанализированных для этих вычислений: n = 120-760, кроме верхнего правого окна n = 43). Клетки классифицируются и кодируются цветом на основе соотношения CDK2 сразу после первого митоза. B) Тепловые карты следов CDK2 от отдельных клеток, выращенных в A, отсортированные с помощью вычислений. Тепловые карты верхней панели отсортированы от CDK2 _{, младшего} до CDK2 _{высокого} в конце периода визуализации. Тепловые карты нижней панели отсортированы по времени митоза (M) в начале периода визуализации.Легенда показывает цветовую карту CDK2. n = 321 трасса для каждой тепловой карты.

Чтобы более точно изучить время событий (удаление Zn ²⁺ , митоз и судьба клеток) и сравнить с поведением по удалению митогена, мы построили тепловые карты следов отдельных клеток с течением времени (рис. 3B). Мы с помощью вычислений сгруппировали следы клеток по их активности CDK2 в конце периода роста, демонстрируя 1) две основные судьбы клеток ZD: покой в ​​красном цвете и остановку на промежуточном CDK2 в зелено-бирюзовом цвете и 2) то, что если клетки делились больше, чем Через 8 часов после добавления TPA они вошли в состояние покоя сразу после деления клеток (верхняя панель рис. 3В).Если клетки делились в течение 8 часов после добавления TPA, большинство из них снова входило в клеточный цикл и останавливалось на промежуточной активности CDK2 (зеленый-бирюзовый), что соответствовало неспособности продвинуться дальше S-фазы. Поскольку время между добавлением TPA и делением клеток увеличивалось с 0 до ~ 8 часов, большая часть клеток испытывала длительный период низкой активности CDK2 (более длинная красная полоса) перед повторным входом в клеточный цикл. Эти результаты предполагают, что если клетки испытывают короткое окно дефицита Zn ²⁺ , у них больше шансов повторно войти в клеточный цикл; но по мере увеличения продолжительности времени клетки испытывают длительные приступы низкой активности CDK2, предполагая, что Zn ²⁺ играет роль в процессах, участвующих в повышении активности CDK2, способствуя вхождению в клеточный цикл.Напротив, большинство ячеек в ММ продолжали циклически перемещаться на протяжении всего окна измерения.

Для сравнения покоя, вызванного дефицитом Zn ²⁺ , с выводом митогена, мы сопоставили трассы CKD2 с помощью вычислений по времени митоза, с первым событием митоза в верхней части тепловой карты (3B, нижняя панель). Ранее этот анализ продемонстрировал, что, если митогены удаляются из новорожденных клеток CDK2 ^inc , они завершают один дополнительный раунд клеточного цикла (16), указывая на то, что достижение определенного порога активности CDK2 отмечает обязательство клеточного цикла, независимо от митогена. доступность.При выравнивании аналогичным образом (рис. 3B, внизу) наши кривые показывают, что окно активности CDK2, которое определяет обязательство клеточного цикла в отношении удаления митогена, не применяется к удалению Zn ²⁺ . Вместо этого, как предполагают другие представления данных, даже если клетки проходят точку рестрикции для митогенов, они останавливаются на промежуточной активности CDK2 в отсутствие достаточного количества Zn ²⁺ , предполагая, что покой, вызванный дефицитом Zn ²⁺ , действует через различные пути по сравнению с выводом митогена.

Дефицит Zn

²⁺ вызывает дефект синтеза ДНК

Поскольку мы обнаружили большую популяцию клеток, которые остановились на промежуточной активности CDK2 в условиях дефицита Zn ²⁺ , и предположили, что эти клетки остановились в S-фазе, мы хотели измерить, способны ли эти клетки к синтезу ДНК. Мы выращивали клетки, как показано на рисунке 3, измеряли включение 5-этинил-2’-дезоксиуридина (EdU) в течение 15-минутного окна мечения в конце этого периода роста и окрашивали на содержание ДНК с использованием йодида пропидия / РНКазы.График зависимости интенсивности EdU от содержания ДНК для отдельных клеток выявил ожидаемое распределение фаз клеточного цикла, где отрицательные клетки EdU (Edu ^—) с 2N ДНК находились в состоянии покоя (G0) или G1, клетки EdU ^— с 4N ДНК находились в состоянии покоя. G2 или M, и EdU-положительные клетки (Edu ⁺ ), переходящие между 2N и 4N, находились в S-фазе (фиг. 4A, фазы клеточного цикла показаны в прямоугольниках на правом графике). В MM и ZR график зависимости плотности содержания Edu от плотности ДНК соответствовал классическому распределению дуги, как было обнаружено ранее для MCF10A в полноразмерных средах для выращивания (45).В условиях ZD клетки не проявляли высокой интенсивности EdU, что указывает на нарушение нормального синтеза ДНК, и большая часть клеток была EdU ^— с содержанием ДНК 2N, что соответствовало состоянию покоя. Интересно, что в условиях ZD многие клетки с содержанием ДНК от 2N до 4N демонстрировали некоторое окрашивание Edu выше, чем у клеток, классифицированных как EdU ^—, что позволяет предположить, что некоторые клетки способны переходить в S-фазу, начинать синтез ДНК, но с меньшей скоростью в 15-минутный интервал. Интенсивность EdU для клеток, выращенных в 2 мкМ TPA, была немного выше, чем для клеток, выращенных в 3 мкМ TPA, демонстрируя, что 2 мкМ TPA является более мягким состоянием ZD и нарушение синтеза ДНК было менее серьезным.Эти данные подтверждают наши выводы из рисунка 3, где помимо покоя существует клеточная судьба с промежуточной активностью CDK2. Это состояние промежуточной активности CDK2 действительно является S-фазой, на что указывают клетки, претерпевающие синтез ДНК, хотя и с меньшей скоростью. Таким образом, хотя эти клетки пересекли переход G1 / S, Zn ²⁺ необходим в S-фазе, чтобы синтез ДНК протекал с нормальной скоростью и чтобы клетки завершили синтез ДНК и продвинулись до G2 / M.

Рис. 4. Дефицит Zn ²⁺ вызывает нарушение синтеза ДНК.

A) Графики плотности отдельных клеток, проанализированных на включение EdU и содержание ДНК. Включение EdU измеряли через 15 минут инкубации после 24 часов роста в условиях ZD (3 мкМ или 2 мкМ TPA), MM или ZR (n = 1437, 916, 817, 676 соответственно из 2-4 лунок на условие). Иодид пропидия (PI) плюс РНКаза использовали для окрашивания на содержание ДНК, определяющее популяции 2N и 4N. Фазы клеточного цикла были классифицированы по их положению на графике 2D Edu против ДНК (показано красным). Б) Репрезентативные изображения клеток для окрашивания Edu и PI для каждого условия роста.Отрицательные клетки EdU обведены белой штриховой линией. Шкала показывает 20 мкм.

Zn

^{2+ Дефицит} приводит к увеличению уровня повреждения ДНК в циклических клетках

Клетки, которые испытывают легкое повреждение ДНК, могут временно выйти из клеточного цикла и войти в состояние покоя, чтобы избежать передачи поврежденного генома следующему поколению . Учитывая, что долгосрочный (многодневный) рост в среде с дефицитом Zn ²⁺ , как ранее было показано с помощью анализа комет, увеличивает повреждение ДНК в популяции клеток (31–33), мы задавались вопросом, является ли мягкий Zn ²⁺ дефицит может вызвать повреждение ДНК в более короткие сроки, и может ли это повреждение ДНК быть причиной покоя, вызванного дефицитом Zn ²⁺ .Кроме того, поскольку мы обнаружили, что условия ZD вызывают дефект в синтезе ДНК, мы хотели оценить, испытывали ли клетки, остановившиеся в S-фазе, стресс репликации. Поскольку мы наблюдали гетерогенность судьбы клеточного цикла при изъятии Zn ²⁺ , мы стремились измерить повреждение ДНК на уровне отдельной клетки и сопоставить его с маркером клеточного цикла. Ранее Арора и его коллеги определили, что то, входят ли естественные циклические клетки в состояние покоя и сколько времени они проводят в состоянии покоя, частично объясняется уровнями повреждений ДНК с двухцепочечным разрывом (DSB), унаследованными от материнских клеток, которые измеряются путем отслеживания флюоресцентных фокусов 53BP1 (известный маркер DSB) (42).Примерно в то же время Barr и соавторы продемонстрировали, что как DSB, так и однонитевые разрывы (SSB, измеренные по фокусам RPA2) во время S фазы вносят вклад в индукцию покоя (46). Мы использовали аналогичный подход, количественно оценив точки 53BP1 и RPA2 в отдельных ячейках, чтобы идентифицировать присутствие DSB и SSB, соответственно. Мы коррелировали маркеры повреждения ДНК с клеточным циклом, используя статус фосфо-Rb в сотнях отдельных клеток, подвергшихся 24-часовому воздействию в условиях роста ZD, MM или ZR, где клетки, которые были гипо-pRb, были классифицированы как покоящиеся, а гипер-pRb клетки были классифицированы как циклические (G1, S, G2 или M).Для клеток, классифицированных как покоящиеся (hypo-pRb), было очень мало различий в фокусах 53BP1 (DSB) или RPA2 (SSB) между различными условиями среды, хотя наблюдалось небольшое увеличение клеток с DSB в ZD по сравнению с MM и ZR. СМИ (67% против 59% и 53%, рисунок 5). Эти результаты предполагают, что повреждение ДНК, вероятно, не является основным механизмом индукции покоя в клетках с дефицитом Zn ²⁺ . Однако в циклических клетках наблюдалось увеличение фокусов 53BP1 (84% для ZD против ~ 50% для MM и ZR) и фокусов RPA2 (~ 20% для ZD по сравнению с <5% для MM и ZR).Повреждение ДНК измеряли через 24 часа в соответствующих средах, и для клеток в ZD этот момент времени соответствует примерно 60% клеток в состоянии низкой активности / покоя CDK2 и 40% клеток застопорились в состоянии с промежуточным CDK2. активность, соответствующая S-фазе (рис. 3В, 24-часовой временной интервал). Учитывая увеличение повреждений ДНК в циклических клетках, но относительно незначительное изменение повреждений ДНК в покоящихся клетках, мы предполагаем, что клетки с повышенным повреждением ДНК соответствуют клеткам, остановившимся в клеточном цикле в фазе S (рис. 3), и что Zn ^{2+ Дефицит} вызывает дефект синтеза ДНК (рис. 4), который способствует неспособности этих клеток прогрессировать до G2 / M.Наши результаты также предполагают, что дефицит Zn ²⁺ может вызывать покой независимо от индукции повреждения ДНК, потому что те клетки, которые перешли в состояние покоя к 24 часам, не демонстрируют значительного увеличения повреждения ДНК.

Рисунок 5. Дефицит Zn ²⁺ приводит к увеличению повреждений ДНК.

A) Клетки выращивали в среде ZD, MM или ZR в течение 24 часов, а затем окрашивали антителами к pRB и либо 53BP1 (маркер DSB), либо RPA2 (маркер SSB). Статус pRB каждой клетки использовали для классификации клеток как неподвижных (гипо-pRB) или циклических (гипер-pRB).Фокусы были идентифицированы с использованием специального сценария MATLAB. На графике нанесена доля клеток, положительных по повреждению ДНК (наличие очагов 1+). Значения n для каждого условия следующие: 53BP1: 1637, 1980 и 2621 для ZD, MM и ZR; RPA2: 489, 2269 и 2439 для ZD, MM и ZR. Б) Типичные изображения для окрашивания 53BP1 и RPA2 для условий ZD и MM. Шкала показывает 20 мкм.

Покой, индуцированный дефицитом Zn

²⁺ , не требует p21

p21 — это циклинзависимый ингибитор киназы, который связывается и ингибирует активность комплексов циклин-CDK, регулируя, таким образом, развитие клеточного цикла.p21 активируется в ответ на контактное ингибирование и отмену фактора роста и способствует остановке клеточного цикла при этих нарушениях (47). Кроме того, p21 является мишенью для транскрипции p53, и было показано, что он активируется в ответ на повреждение ДНК, что приводит к остановке клеточного цикла и, предположительно, делает возможным восстановление ДНК до повторного входа в клеточный цикл. Таким образом, p21 стал важным регулятором решения о приостановке пролиферации (19, 46). Это подтверждается наблюдением, что в нулевых клетках p21 частота спонтанного покоя снижается (16, 42).Учитывая, что дефицит Zn ²⁺ влияет на развитие клеточного цикла, вызывая покой, и что он также приводит к увеличению повреждения ДНК, мы попытались определить, требуется ли для покоя, вызванного дефицитом Zn ²⁺ , p21. Мы выращивали клетки WT и p21 — / — MCF10A, экспрессирующие репортер CDK2, и измеряли долю клеток в каждой классификации (CDK2 ^{low / emerge / high} ) в условиях ZD, MM и ZR (рис. 6A). В клетках WT, выращенных в MM или ZR, 17% или 16% (соответственно) клеток были классифицированы как покоящиеся (CDK2 ^low ), в то время как в клетках p21 — / — только 8% или 5% клеток были классифицированы как покоящиеся, согласуются с предыдущими результатами, предполагающими, что спонтанное покой в ​​естественных циклических клетках индуцируется эндогенным повреждением ДНК и зависит от p21 (42, 46).В условиях ZD покой происходил с одинаковой скоростью в клетках p21 — / — и WT (42% против 56%), предполагая, что покой, вызванный дефицитом Zn ²⁺ , явно не требует p21 (Рисунок 6A). Возможно, это неудивительно, учитывая, что популяция клеток, которая находилась в состоянии покоя после 24 часов роста в среде с дефицитом Zn ²⁺ , не демонстрировала повышенного повреждения ДНК (Фиг.5). В совокупности наши данные показывают, что дефицит Zn ²⁺ вызывает покой через p21-независимый путь.Поскольку p21 также активируется для поддержания покоя (15), мы измерили уровни p21 в клетках WT MCF10A с помощью иммунофлуоресценции после 40 часов роста. В среде ZD клетки, которые сохраняли низкую активность CDK2, имели более высокие уровни p21, аналогичные клеткам в среде MM (фигура 6B). Эти данные предполагают, что, хотя p21 не требуется для перехода в состояние покоя, в клетках WT p21 активируется, когда клетки находятся в состоянии покоя, вероятно, для поддержания их состояния покоя путем подавления активности CDK2.

Рисунок 6. Покой, вызванный дефицитом Zn ²⁺ , не требует p21.

A) Одноклеточные следы CDK2 клеток WT (вверху) и p21 — / — (внизу) MCF10A, выращенных в среде ZD, MM или ZR. Графики показывают n = 120 случайных кривых, выбранных из 8 отдельных лунок. Следы CDK2 были сопоставлены с помощью вычислений по митозу и окрашены в соответствии с классификацией клеточных судеб. % общих трасс, отнесенных к каждой категории, перечислены ниже трасс (рассчитано из общего количества трасс n = 410-3445). B) Соотношение CDK2 в зависимости от интенсивности p21 в клетках WT MCF10A в фиксированный момент времени после 40 часов роста в среде ZD или MM. p21 детектировали с помощью антитела против p21 (для ZD n = 412 клеток, собранных из 3 лунок; для MM, n = 1414 клеток, собранных из 3 лунок).

Zn

²⁺ пополнение запасов индуцирует синхронизированный повторный вход в клеточный цикл

Чтобы определить, является ли индуцированное дефицитом Zn ²⁺ состояние покоя обратимым, мы выращивали клетки в течение 24 часов в среде ZD, а затем 36 часов с MM или ZR СМИ. Пополнение запасов Zn ²⁺ вызывало увеличение активности CDK2 и возобновление митозов (красные точки), что указывает на активное деление клеток (фигура 7A). Оказалось, что меньшая часть клеток оставалась неподвижной при спасении с помощью ZR, а не при спасении с помощью MM (см. Кривые CDK2 ^low в выделенных окнах на рисунке 7A).Чтобы количественно оценить это, мы построили графики плотности вероятности активности CDK2 для каждого часа после пополнения запасов с помощью MM или ZR (рисунок 7B и дополнительный рисунок 5). После 1 часа пополнения запасов Zn ²⁺ большинство клеток оставалось неподвижным во всех трех условиях (CDK2 ^низкий , средняя активность ~ 0,5). После 8 часов пополнения запасы клетки, которые не пополнялись (ZD), оставались в состоянии низкого уровня CDK2 ^{, в то время как пополненные клетки вышли из состояния покоя и вошли в клеточный цикл, о чем свидетельствует смещение популяций клеток в сторону более высокой активности CDK2, в среднем около 1 .25. Повторно введенные ZR клетки имели более высокую вероятность нахождения в этом более высоком состоянии CDK2 и соответствующую более низкую вероятность нахождения в состоянии низкого} CDK2 ^{по сравнению с клетками, повторно снабженными MM, что предполагает положительную корреляцию между количеством Zn 2+. в среде и возобновление клеточного цикла после периода дефицита.}

Рисунок 7. Пополнение запасов Zn ²⁺ после индуцированного дефицитом Zn ²⁺ покоя позволяет повторно войти в клеточный цикл.

A) Одноклеточные следы CDK2 клеток, выращенных в условиях ZD в течение 60 часов и клеток, выращенных в ZD в течение 24 часов и дополненных средой MM или ZR (n = 80 случайных следов из 4 лунок на условие).Области, заштрихованные желтым или синим цветом, указывают на пополнение запасов носителя. Красные точки указывают на события митоза. B) Гистограммы плотности соотношения CDK2 после того, как клетки либо остаются в среде ZD, либо пополняются MM или ZR. Гистограммы показаны для моментов времени 1 и 8 часов после пополнения запасов (n = 210, 1068 и 1024 для ZD, MM и ZR соответственно для часа 1; n = 187, 1154 и 1139 для ZD, MM и ZR соответственно для часа 8).

Обсуждение

Точное дублирование генома и разделение хромосом на дочерние клетки в процессе цикла клеточного деления — одна из наиболее важных функций, которые должны выполнять отдельные клетки.Регулируемый выход из клеточного цикла в состояние покоя является важным путем контроля качества, который снижает метаболическую и биохимическую активность и защищает клетки от стресса и токсичных метаболитов (48). Учитывая важность понимания факторов, которые регулируют вход в клеточный цикл, его прогрессию и выход в состояние покоя, десятилетия исследований были направлены на определение основных механизмов «решения» о прекращении пролиферации. Большая часть нашего понимания клеточного цикла млекопитающих получена из исследований, в которых популяции клеток были вынуждены выходить из клеточного цикла при индукции стресса, такого как сывороточный голод или аминокислотная депривация.Эти исследования выявили многие ключевые регуляторы клеточного цикла и представили концепцию точки рестрикции, точки, в которой клетки связываются с клеточным циклом и становятся митоген-независимыми. Однако недавнее применение технологий одиночных клеток для отслеживания клеточных и молекулярных маркеров и судьбы отдельных клеток привело к ключевым пересмотрам учебной модели клеточного цикла млекопитающих, включая открытие того, что в естественных циклических клетках существует множество решений о пролиферации (14). , 16–18).Более того, сейчас ценится, но все еще плохо понимается, что покой — это не единичное спящее состояние, а скорее совокупность гетерогенных состояний, которая активно поддерживается (14, 15, 49). Вообще говоря, контроль решения о пролиферации или остановке является фундаментальным для различных аспектов поддержания архитектуры ткани, дифференциации, восстановления повреждений ДНК, заживления ран и роста нормальных и злокачественных клеток (14, 18, 50). Таким образом, понимание того, как отдельные триггеры вызывают покой, важно для окончательного определения целей для улучшения дефицита питания или болезненных состояний.

Опираясь на появляющуюся концептуальную основу изучения клеточного цикла в асинхронных популяциях клеток, в этой работе мы применяем комбинацию флуоресцентных репортеров, высокопроизводительной визуализации и количественного анализа изображений, чтобы вернуться к важному, но нерешенному вопросу о том, как Zn ^{2 Дефицит +} блокирует пролиферацию клеток. Хотя давно было признано, что Zn ²⁺ необходим для пролиферации клеток, то, как дефицит Zn ²⁺ влияет на клеточный цикл на уровне отдельных клеток, не выяснено, и влияет ли Zn ²⁺ на критическую пролиферацию. Решение о судьбе покоящихся клеток не было определено.Zn ²⁺ является важным металлом, который служит критическим кофактором примерно в 10% белков, кодируемых геномом человека (51), включая более 700 факторов транскрипции, содержащих Zn ²⁺ -палец, ДНК-полимеразу, супероксиддисмутазу. , и белки, участвующие в репарации ДНК (52). Таким образом, он необходим для нескольких ключевых клеточных процессов с участием этих белков, включая процессы, относящиеся к клеточному циклу, такие как транскрипция, антиоксидантная защита, синтез и восстановление ДНК.

Часто упускается из виду, что сыворотка не только служит резервуаром для митогенов, но и является основным источником основных питательных микроэлементов, включая Zn ²⁺ , Fe ²⁺ и Mn ²⁺ , и, таким образом, полное удаление сыворотки также устраняет поступление этих и других важных питательных веществ извне. Мы стремились выделить эффект Zn ²⁺ , исследуя депривацию Zn ²⁺ в асинхронной популяции клеток, все еще содержащих достаточные уровни митогена.Мы подвергали клетки умеренным возмущениям Zn ²⁺ , которые изменяли лабильный пул цитозольного Zn ²⁺ между 1 и 210 пМ и избегали индукции гибели клеток. При депривации Zn ²⁺ клетки утратили способность активно пролиферировать, и большинство из них испытали одну из двух клеточных судьб: переход в состояние покоя или остановку в S-фазе, что указывает на то, что в отличие от митогенов не существует единой точки ограничения для Zn ^2+. , возможно, потому, что было бы слишком сложно разработать контрольную точку для каждого питательного вещества, или, возможно, потому, что Zn ²⁺ необходим для очень многих клеточных процессов.Отслеживание отдельных клеток до и после депривации Zn ²⁺ показало временное развитие этих двух разных судеб, демонстрируя, что Zn ²⁺ требуется во многих местах клеточного цикла и глубину дефицита Zn ²⁺ по сравнению с митоз определяет судьбу клетки. Если клетки претерпели митоз в течение 8 часов после вывода Zn ²⁺ , они, вероятно, снова войдут в клеточный цикл и завершат G1 до остановки в S-фазе с заметно удлиненной S-фазой (плато при промежуточной активности CDK2 на рисунке 3A. ).Эти клетки синтезировали ДНК с меньшей скоростью и накапливали повышенное количество повреждений ДНК, что указывает на то, что для поддержания целостности ДНК необходимо достаточное количество Zn ²⁺ . Эти результаты согласуются с предыдущей работой, которая показала на популяционном уровне, что долгосрочный (многодневный) дефицит Zn ²⁺ привел к увеличению повреждений ДНК, измеренных с помощью анализа комет (31, 32). Здесь мы обнаружили, что дефицит Zn ²⁺ увеличивает как DSB, так и SSB в циклических гиперфосфорилированных Rb-клетках (~ 1.7-кратное увеличение DSB и ~ 4-кратное увеличение SSB по сравнению с клетками в MM или ZR). Хорошо известно, что Zn ²⁺ является критическим кофактором в ряде белков, отвечающих за геном, таких как XPA и RPA пути эксцизионной репарации нуклеотидов, PARP, участвующий в эксцизионной репарации оснований, HERC2, участвующий в распознавании DSB, CHFR, участвующий в регуляция контрольных точек и факторы транскрипции, такие как p53 и BRCA, которые участвуют в реакции на повреждение ДНК и репарации (53–55). Хотя исследования in vitro и показывают, что эти белки не будут функционировать без Zn ²⁺ , мало что известно о свойствах связывания металлов в клетках, о том, как мириады белков протеома цинка приобретают свой Zn ²⁺ и влияют ли они на них. белки чувствительны к незначительным нарушениям лабильного пула цинка.Хо и его коллеги продемонстрировали, что длительное истощение Zn ²⁺ снижает связывание факторов транскрипции, таких как p53 и AP1, с ДНК (31) и приводит к дифференциальной экспрессии генов, участвующих в клеточном цикле, а также к ответу на повреждение ДНК и ремонт (33). Однако ничего не было известно о том, насколько быстро клетки ощущают дефицит Zn ²⁺ и как последствия дефицита Zn ²⁺ , такие как усиление повреждения ДНК, коррелируют с судьбой клетки. Прослеживая судьбу клеток с течением времени в ответ на изъятие Zn ²⁺ , мы показали, что отдельные клетки чувствуют истощение лабильного пула Zn ²⁺ быстро (в течение 4 часов) и что клетки в S-фазе уменьшаются. темпы синтеза ДНК и повышенное повреждение ДНК, вызывающее выход из клеточного цикла, несмотря на то, что эти клетки имеют достаточно митогенов, чтобы пройти точку рестрикции.

Если клетки делятся> 8 часов после удаления Zn ²⁺ , подавляющее большинство рождаются с низкой активностью CDK2 и сразу же переходят в состояние покоя. Интересно, что эти клетки не проявляли увеличения повреждений ДНК, и p21 не требовался для перехода в это состояние покоя, что указывает на то, что механизм индукции покоя отличается от механизма спонтанного покоя. Было обнаружено, что вхождение в «спонтанное» состояние покоя, наблюдаемое в клетках с естественным циклом, связано с повышенным уровнем повреждения ДНК из предыдущего клеточного цикла, который зависел от активности p21 (42, 46).Наблюдение за рождением клеток с низкой активностью CDK2 предполагает, что дефицит Zn ²⁺ ощущается в материнской клетке во время предыдущего клеточного цикла. Это новое состояние покоя, вызванное дефицитом питательных микроэлементов, возникает в присутствии митогенов и не индуцируется стрессом репликации / повреждением ДНК. Важно отметить, что покоящиеся клетки и клетки, остановившиеся в S-фазе после периода дефицита Zn ²⁺ , могли быть восстановлены за счет пополнения запасов Zn ²⁺ и были способны повторно войти в клеточный цикл.

Обращаясь к вопросу о том, как умеренный дефицит Zn ²⁺ снижает пролиферацию клеток с помощью современных инструментов на уровне отдельных клеток в естественных циклических клетках, мы обнаружили, что статус Zn ²⁺ влияет на несколько контрольных точек в клеточном цикле, и обнаружили новое состояние покоя, вызванное дефицитом питательных микроэлементов, которое отличается от спонтанного покоя и вывода митогенов. Эти находки важны для понимания того, как этот контроль клеточного цикла может нарушаться при болезненных состояниях, таких как рак, где уровни и локализация Zn ²⁺ нарушены (50, 56-58).Будущие протеомные и транскриптомные исследования могут выявить соответствующие Zn ²⁺ -зависимые белки, которые воспринимают статус Zn ²⁺ , тем самым раскрывая механизм входа в это состояние покоя и ключевые Zn ²⁺ -зависимые белки, ответственные за него. для поддержания целостности генома во время репликации ДНК.

Материалы и методы

Клеточная культура

Клетки MCF10A были получены из ATCC и поддерживались в полноразмерной среде DMEM / F12 (FGM) с добавлением 5% лошадиной сыворотки, 1% антибиотиков Pen / strep, 20 нг / мл EGF, 0 .5 мкг / мл гидрокортизона, 100 нг / мл холерного токсина и 10 мкг / мл инсулина в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и 5% CO ₂ , как описано ранее в лаборатории Брюгге (59). Клетки пассировали трипсин-ЭДТА. Для визуализации и экспериментов по росту клетки выращивали в 50:50 Ham’s F12 без фенолового красного / FluoroBrite ^TM DMEM с 1,5% обработанной Chelex ^® 100 лошадиной сывороткой, 1% антибиотиками Pen / strep, 20 нг / мл EGF, 0,5 мкг / мл гидрокортизона, 100 нг / мл холерного токсина и 10 мкг / мл инсулина, обработанного Chelex ^® 100.Chelex ^® 100 использовали для хелатирования избытка Zn ²⁺ из лошадиной сыворотки и инсулина для создания определенной минимальной среды (MM). Среду ZR получали добавлением к MM 30 мкМ ZnCh, а среду ZD получали добавлением 2-3 мкМ TPA. Клеточные линии тестировались в обычном порядке и с помощью ПЦР подтверждались как отрицательные на микоплазмы.

ICP-MS

ICP-MS использовали для измерения общего содержания Zn ²⁺ в определенном ММ с обработкой Chelex ^® 100 сыворотки и FGM и без нее.2% азотная кислота в Chelex ^® 100 Milli-Q воды добавляли к каждому образцу среды. В образцы добавляли 5 частей на миллиард (ppb) двух элементов внутреннего стандарта, иттрия (Y) и галлия (Ga), для исправления технических ошибок или ошибок человека. Подсчет ионов Zn ²⁺ в каждом образце, измеренный с помощью ICP-MS, корректировали на отношение измеренного Y или Ga (частей на миллиард) к известному количеству Y или Ga (частей на миллиард). Затем счетчики ионов Zn ²⁺ были преобразованы в ppb с использованием стандартной кривой Zn ²⁺ .Образцы были отправлены для анализа ICP-MS в лабораторию LEGS в CU Boulder.

Плазмиды и клеточные линии

Клеточные линии MCF10A, экспрессирующие PB-NES ZapCV2 (41) и PB-h3B-mCherry, были получены с использованием системы транспозонов PiggyBac ™ посредством трансфекции, опосредованной электропорацией. Стабильные клеточные линии, используемые для долгосрочной визуализации, были получены с помощью G418 и отбора антибиотика пуромицина с последующим обогащением FACS двойными положительными флуоресцентными клетками. Клеточная линия MCF10A, стабильно экспрессирующая DHB-Venus (сенсор CDK2) и h3B-mTurquoise2, и MCF10A p21 — / — были предоставлены лабораторией Dr.Sabrina Spencer, CU Boulder, и генерировали, как описано ранее (16). Подтверждение нокаута p21 в этой клеточной линии выполняли с использованием иммунофлуоресценции с антителом p21, как описано ниже (см. Дополнительный рисунок 6).

Визуализация живых клеток

Клетки подсчитывали с помощью автоматического счетчика клеток Countess ™ II (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) и высевали при плотности 2500–3500 клеток / лунку ~ 24 часа перед визуализацией в минимальной среде на стеклянном дне 96-луночные планшеты (P96-1.5H-N, Cellvis, Маунтин-Вью, Калифорния). Эта начальная плотность была выбрана, чтобы избежать значительного контактного ингибирования во время визуализации. На рис. 1, 2 и 5 клетки высевали в 100 мкл MM и 2x среды для каждого конкретного режима питания (ZD, MM, ZR) добавляли непосредственно перед визуализацией. На Фигуре 3 клетки помещали в 100 мкл MM, и через 8 часов добавляли среду 2x ZD. На Фигуре 7 клетки помещали в 100 мкл, 2x среды в определенных условиях добавляли непосредственно перед визуализацией; через 24 часа удаляли 100 мкл среды и повторно добавляли 2x среды в указанных условиях.Изображения были получены с использованием инвертированного микроскопа Nikon Ti-E со световым процессором Lumencor SPECTRA X ^® (Lumencor, Бивертон, Орегон) и камерой Hamamatsu Orca FLASH-4.0 V2 cMOS (Hamamatsu, Япония). Изображения собирали в серии интервальных съемок каждые 12 минут с помощью объектива 10X 0,45 NA Plan Apo (Nikon Instruments, Мелвилл, Нью-Йорк). Во время визуализации клетки находились в камере с контролируемой окружающей средой, окружающей микроскоп (Okolab Cage Incubator, Okolab USA INC, Сан-Бруно, Калифорния) при 37 ° C, 5% CO ₂ и влажности 90%.Общее время воздействия света было <600 мс на момент времени. Наборы фильтров, используемые для визуализации живых клеток и иммунофлуоресценции (описаны ниже), были следующими: CFP Ex: 440 Em: 475/20; GFP Ex: 470, Em: 540/21; YFP Ex: 470, Em: 540/21; CFPYFP FRET Ex: 395, Em: 540/21; mCherry Ex: 555, Em: 595/40; Cy5 Ex: 640, Em: 705/22.

Обработка / анализ изображений

Подробное описание нашего настраиваемого конвейера MATLAB R2018A (Mathworks) для автоматической сегментации и отслеживания ячеек, а также методы для расчета отношения FRET и отношения CDK2 представлены в дополнительном примечании, а код отслеживания доступно для скачивания здесь: https: // biof-git.colorado.edu/biofrontiers-imaging/palmer-zinc-cell-cycle. Вкратце, события митоза были идентифицированы, когда ядерный сигнал, генерируемый флуоресцентным h3B, расщеплялся на два отдельных объекта. Отношение FRET (интенсивность FRET / интенсивность CFP) рассчитывали в цитозольной области за пределами ядерной маски, а соотношение CDK2 рассчитывали как интенсивность цитозоля / интенсивность ядра флуоресцентного сенсора CDK2.

FACS

Осадки клеток промывали PBS, фиксировали 4% параформальдегидом и повышали проницаемость метанолом при -20 ° C.Клетки окрашивали в течение одного часа с помощью Phospho-Rb Ser 807/811 (D20B12 XP ^® , Cell Signaling Technology, Danvers, MA) в разведении 1: 500 перед вторичным антителом Alexa Fluor ™ 488 (ab150073, Abcam, Cambrdige, MA). ) окрашивание в разведении 1: 500 в течение одного часа. Антитела разводили в PBST с 1% BSA. Окрашивание ДНК PI выполняли с использованием FxCycle ™ PI / РНКазы (Thermo Fisher Scientific F10797). FACS для фосфо-Rb и PI выполняли на приборе BD FACSCelesta ™ и анализировали с помощью программного обеспечения BD FACSDiva ™ v8 (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния).GFP: Ex 488, Em 530/30; mCherry Ex 561, Em 610/20. FACS-обогащение стабильных клеточных линий выполняли с использованием BD FACSAria ™ Fusion со следующей оптикой: CFP: Ex 445, Em 470/15; YFP: Ex 488, Em 530/30; и mCherry Ex 561, Em 610/20.

Иммунофлуоресценция

Клетки фиксировали 4% параформальдегидом, промывали PBS и повышали проницаемость 0,2% раствором Тритона X-100. Блокирование проводили в 3% BSA в течение одного часа при 4 ° C. Первичное окрашивание антител происходило в течение ночи при 4 ° C со следующими концентрациями антител: p21, 1: 200; pRB, 1: 100, RPA2, 1: 250; 53БП1, 1: 200.После первичного окрашивания клетки промывали PBS, а вторичное окрашивание антител выполняли в течение одного часа с помощью AlexaFluor ^TM 488, AlexaFluor ™ 568 или AlexaFluor ™ 647, каждый в разведении 1: 500. Антитела разводили в PBS с 3% BSA. Для идентификации ядер использовали окрашивание по Hoechst в течение 15 минут при 0,1 мкг / мл, разведенном в PBS. Для экспериментов по сравнению активности CDK2 с интенсивностью p21 флуоресценция сенсора CDK2 сохранялась после фиксации. Изображения были получены на инвертированном микроскопе Nikon Ti-E (как описано в разделе «Визуализация живых клеток») с увеличением 40X0.95 NA Plan Apo Lamda (Nikon). Используемые первичные антитела: p21 Waf1 / Cip1 (CST, 2947S, Lot 10), pRB Ser807 / 811 (CST, D20B12 XP ^® , Lot8), RPA2 (Abcam, ab2175, Lot GR3224197-5), 53BP1 (BD Biosciences , 612523, лот 6217571), а второстепенными были: AlexaFluor ™ 488 (Abcam, ab150073, Lot GR328726-1), AlexaFluor ™ 568 (Life Sciences A10042, лот 1134929) или AlexaFluor ™ 647 (Thermo Fisher Scientific, A-21236, лот 1973453). Анализы выполнялись с помощью пользовательских сценариев MATLAB и выполнялись в MATLAB R2018a.Вкратце, ядра были сегментированы с использованием комбинации адаптивного порогового определения и алгоритма водораздела для сегментации скоплений клеток. Ядерную маску использовали для расчета средней ядерной интенсивности pRB или p21 для каждой клетки.

Для клеток, содержащих сенсор CDK2, ядерную маску использовали для рисования кольца шириной 3 пикселя вокруг ядра для вычисления активности CDK2 (определяемой как отношение интенсивности цитоплазмы / интенсивности ядра) клетки. Для экспериментов по повреждению ДНК центроид каждой клетки (как определено ядерной маской) использовали для построения квадрата 140 x 140 пикселей вокруг каждой клетки; это позволило использовать функцию «adapthresh» MATLABs для построения точной маски фокусов для каждой ячейки.Маска фокусов была дополнительно уточнена путем фильтрации любых объектов, не подходящих по размеру (область 10–100 пикселей ² для RPA2 и 10–200 пикселей ² для 53BP1) или формы (эксцентриситет <0,6, где 0 - идеальный круг, а 1 - прямая линия). Клетки оценивались как положительные на повреждение, если в них присутствовал 1 или более очагов.

EdU assay

Живые клетки, содержащиеся в контролируемых условиях окружающей среды (37 ° C, 5% CO ₂ , влажность 90%), были помечены EdU в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Fisher Scientific, C10356).Вкратце, клетки метили 10 мкМ EdU в течение 15 минут с последующей фиксацией и пермеабилизацией, как описано для иммунофлуоресценции. Клетки метили в течение 30 минут посредством реакции щелчка азидом AlexaFluor ™ 647 с использованием CuSO ₄ в качестве катализатора. ПИ / РНКазу FxCycle ™ использовали для количественной оценки содержания ДНК (2N против 4N). Изображения получали на системе инвертированного микроскопа Nikon Ti-E с 40X 0.95 NA Plan Apo Lambda (Nikon). Анализ был выполнен с помощью пользовательских сценариев MATLAB и запущен в MATLAB R2018a.Рабочий процесс анализа был таким же, как и для иммунофлуоресценции, за исключением того, что окрашивание EdU с высоким остаточным фоном требовало вычитания фона перед определением интенсивности. Вычитание фона выполнялось путем разделения изображения на блоки 11 x 11 и последующего использования самого низкого значения интенсивности 5-го процентиля для каждого блока в качестве фона. Количественную оценку содержания ДНК проводили путем вычисления интегрированной интенсивности каждой клетки.

Калибровка и анализ сенсора FRET

Калибровка сенсора клеток MCF10A, стабильно экспрессирующих PB-NES-ZapCV2, была проведена с использованием Nikon Ti-E.Клетки выращивали в течение 24 часов в среде ZD (3 мкМ TPA), MM или ZR. Для сбора R _rest клетки визуализировали для CFP-YFP FRET (экспозиция 200 мс) и CFP (экспозиция 200 мс) каждые 30 секунд в течение нескольких минут. Для сбора R _мин добавляли 50 мкМ TPA в MM, и клетки снова отображали в течение нескольких минут. Затем клетки трижды промывали HBSS, забуференным HEPES и не содержащим фосфатов, кальция и магния, pH 7,4, для удаления TPA. Наконец, для сбора R _max клетки обрабатывали этим буфером HBSS с 119 нМ забуференным раствором Zn ²⁺ , 0.001% сапонина и 5 мкМ пиритиона, как описано ранее (60). Среднее значение _RR и _RR было рассчитано путем усреднения по собранным временным точкам. Максимальное соотношение FRET, достигаемое после добавления Zn ²⁺ , использовали в качестве R _max . Изображения были скорректированы по фону путем рисования интересующей области в темной области изображения и вычитания средней интенсивности флуоресценции фона из средней интенсивности каждой ячейки. Соотношения FRET для каждой клетки (n = 8 на условие) рассчитывали по следующему уравнению: (FRET _{, интенсивность} клетки — FRET _{, интенсивность} фона) / (CFP _{, интенсивность} клетки — CFP _{, интенсивность} фона) .Динамический диапазон (DR) датчика в каждом состоянии рассчитывался как R _max / R _min . Дробное насыщение (FS) датчика в каждом состоянии рассчитывалось следующим образом: (R _ост. -R _мин. ) / (R _макс. -R _мин. ). Наконец, концентрации Zn ²⁺ оценивались по формуле [Zn ²⁺ ] = K _D ((R _{остаток} — R _мин ) / (R _max — R _{остаток} )) ^{1 / n} , где K _D = 5300 пМ и n = 0.