Методы окраски

ОКРАСКА
МИКРООРГАНИЗМОВ — комплекс методов и
приемов, применяемый для изучения
морфологических свойств микроорганизмов.
В нативном (естественном) состоянии
бактерии имеют такой же коэффициент
преломления, как и стекло, поэтому они
невидимы под микроскопом. Благодаря О.
м. можно изучать их морфол. особенности,
что необходимо при проведении
бактериологического исследования.
Окрашивание бактерий производится как
для обнаружения их в исследуемом
материале при бактериоскопической
диагностике, так и для их идентификации
после выделения чистой культуры из
исследуемого материала при бактериол.
исследовании.

Приготовление
окрашенного препарата состоит из
следующих этапов: приготовление мазка,
его высушивание, фиксация и окраска.
Для приготовления мазка на середину
чистого предметного стекла наносят
небольшую каплю воды и с помощью
бактериальной петли помещают в нее
исследуемый материал. Материал равномерно
распределяют на стекле таким образом,
чтобы образовался тонкий мазок круглой
или овальной формы размером 1-2 см2. Затем
препарат высушивают либо при комнатной
температуре на воздухе, либо в струе
теплого воздуха высоко над пламенем
горелки. Высушенный мазок подвергают
фиксации, вследствие чего он прикрепляется
к стеклу (фиксируется), микробы
инактивируются и становятся безопасными,
возрастает их восприимчивость к окраске.
Применяют различные способы фиксации.
Наиболее простым и самым распространенным
способом является фиксация жаром —
нагреванием на пламени горелки (препарат
несколько раз проводят через наиболее
горячую часть пламени горелки). В нек-рых
случаях прибегают к фиксации препарата
этиловым или метиловым спиртом, ацетоном,
смесью равных объемов этилового спирта
и эфира (по Никифорову). После фиксации
производят окраску мазка. Наиболее
пригодными для окраски микробов являются
основные и нейтральные анилиновые
красители. Окрашенный препарат промывают
водой и высушивают. На высушенный мазок
наносят каплю иммерсионного масла и
микроскопируют, пользуясь иммерсионной
системой микроскопа.

Существуют
простые и сложные способы окрашивания
микробов. При простой окраске, к-рая
позволяет быстро изучить морфол.
особенности микробов, обычно используют
только один краситель, чаще всего
красного цвета — фуксин (окраска
производится в течение 1-2 мин) или синего
цвета — метиленовый синий (время обработки
мазка краской 3-5 мин). При сложных методах
окраски применяют два или более
контрастных красителя, протравы,
дифференцирующие вещества и др. Среди
сложных методов окраски различают
дифференциальные методы и методы,
предназначенные для выявления отдельных
структур клетки. К дифференциальным
методам относятся методы Грама и
Циля-Нельсена, позволяющие различать
по цвету микроорганизмы, сходные по
морфол. свойствам.

Метод
окраски по Граму — наиболее распространенный
сложный способ окраски. Бактерии в
зависимости от того, подвергаются они
окраске по этому методу или нет, разделяют
на две группы: грамположительные
(красящиеся по Граму) и грамотрицательные
(не красящиеся) Различие в окраске
обусловлено разным строением клеточной
стенки грамположительных и грамотрицательных
бактерий.

Методика
окраски по Граму заключается в
последовательной обработке фиксированного
мазка: окраске генцианвиолетом через
фильтровальную бумагу (1-2 мин), обработке
р-ром Люголя (1 мин), обесцвечивании
спиртом (1/2-1 мин — до отхождения фиолетовых
струек краски), промывании водой,
окрашивании фуксином (1-2 мин). Сущность
метода состоит в том, что грамположительные
бактерии удерживают комплекс краситель
— йод и не обесцвечиваются спиртом,
грамотрицательные не обладают этим
свойством, т. е. обесцвечиваются спиртом
(дифференцирующим веществом) и
докрашиваются фуксином. В результате
грамположительные бактерии приобретают
фиолетовый цвет, грамотрицательные —
красный.

Метод
Циля-Нельсена предназначен для
дифференциации кислотоустойчивых
бактерий (возбудителей туберкулеза и
лепры) от некислотоустойчивых. При
окраске по этому методу используют
карболовый фуксин Циля, серную к-ту
(дифференцирующее вещество) и метиленовый
синий. Кислотоустойчивые бактерии
окрашиваются в красный цвет карболовым
фуксином Циля и не обесцвечиваются
к-той, некислотоустойчивые теряют
красную окраску при обработке к-той и
докрашиваются метиленовым синим.

При изучении
структуры микробной клетки используют
целый ряд сложных методов. Так, для
выявления капсулы у бактерий применяют
метод Гинса, для обнаружения спор
бактерий — метод Ауески, зерна волютина
можно окрасить с помощью метода Нейссера.
Для выявления жгутиков используют
методы «сверхокраски», при к-рых
клетки и отдельные их структуры
увеличиваются в размерах и становятся
видимыми под световым микроскопом. К
методам «сверхокраски» относится,
в частности, метод серебрения по Морозову.
Он также может быть использован для
окрашивания спирохет и даже наиболее
крупных вирусов — вирусов оспы.

Универсальным
методом О. м. является окраска по
Романовскому-Гимзе (смесью азура, эозина
и метиленового синего). При окрашивании
простейших их цитоплазма приобретает
голубой цвет, а ядра — красно-фиолетовый.
Этот метод используют также при
исследовании риккетсий, хламидий,
спирохет, форменных элементов крови.

Метод окраски микропрепаратов по Романовскому-Гимзе

Метод окраски микропрепаратов по Романовскому-Гимзе — это один из самых популярных методов окрашивания бактерий, простейших, а так же клеточных структур и тканей самых различной структуры. Данный м метод используется в том числе и для исследований крови посредством световой оптической микроскопии. Окраска по Пинчуну-Романовского-Гимзе впервые была предложена в 1904 году Густавом Гимзой.

Посредством данного метода окраске подлежат ацидофильные образования в разные оттенки красного цвета. Образования базофильного характера окрашиваются в цвет от пурпурного до синего.

Момент окрашивания:

Перед началом окрашивания готовый краситель жидкого вида разводят в дистиллированной воде в соотношении 1-2 капель красителя на 1 мг воды. Мазки окрашиваются во влажной камере при температуре  37 °C в течение 20-25 минут. После завершения окраски мазки промываются проточной водой, сушатся на воздухе, а затем исследуются с помощью масляных импрессий.

Красящую смесь Романовского-Гимзы, в основе которой имеется краска Романовского Райта, растворяют в виде порошка в смеси равноправных объемах глицерина и метилового спирта в соотношении 800 мг красителя к 100 мл растворителя.

Краситель обладает плохой растворимостью, поэтому его следует перетереть  с растворителем  в количественном соотношении 300мг к 100 мг, затем, добавлять краситель при этом постоянно помешивать массу до получения требуемой концентрации. На приготовление красителя требуется несколько дней. Следует акцентировать внимание на том, что в качестве растворителей нужно применять химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как именно примеси являются причиной ухудшения свойств красителя. 100 % этиловый спирт может стать идеальной заменой метиловому спирту. Готовую красящую смесь следует хранить в плотно закрытом  сосуде в прохладном сухом месте.

Специальный раствор Гимза. Составляющие красителя:

• Азур 1 — 3,772 г
• Эозин — 2,165 г
• Метиленовая синька (медиц.) — 1,563 г
• Метанол (ЧДА) — 750,0 мл
• Глицерин (ЧДА) — 256,0 мл

Метод окрашивания:

Мазки, акцентированные в метиловом спирте, окрашивают на протяжении 40-120 минут раствором, в состав которого входят 1 мл приготовленной краски жидкой формы, 2 мл главного буферного раствора и 47 мл дистиллированной воды. Используют фосфатный буфер, на рН которого оказывает влияние вид мазка:

• мазок костного мозга — 5,8 — 6,0;
• мазок крови — 6,4 — 6,5;
• выявление простейших — 6,8;
• малярийные плазмодия — 7,0 — 7,2.

Ополаскивание проводят в дистиллированной воде, затем высушивают и изучают при иммерсии.

Результаты окрашивания:

Амастиготы Leishmania tropica, находящиеся – в макрофагах. Увеличение 10×100, окрашивание по Гимзе.

Бактерии вследствие окрашивания приобретают фиолетово-красный оттенок, цитоплазма клеток —  голубой цвет, ядра —  красный. Вследствие окраски простейших их цитоплазма становится голубого цвета, а ядра — красно-фиолетового.

3.2B: Общие методы окрашивания — Биология LibreTexts

1. Последнее обновление

2. Сохранить как PDF

• Безграничный
• Безграничный

Цели обучения

• Сравнить и сопоставить окрашивание in vitro и in vivo

Окрашивание — это метод, используемый в микроскопии для повышения контрастности микроскопического изображения. Пятна и красители часто используются для выделения структур микробов для просмотра, часто с помощью различных микроскопов. Окрашивание можно использовать для определения и исследования различных типов микробов, различных стадий клеточной жизни (например, митотического цикла) и даже органелл внутри отдельных клеток (например, митохондрий или хлоропластов).

Окрашивание in-vivo — это процесс окрашивания живой ткани — in vivo означает «в жизни» (в отличие от окрашивания in-vitro ). Когда определенная клетка или структура приобретает контрастный цвет (цвета), ее форму (морфологию) или положение в клетке или ткани можно легко увидеть и изучить. Обычная цель состоит в том, чтобы выявить цитологические детали, которые в противном случае могли бы остаться незамеченными; однако окрашивание также может выявить, где в клетках происходят определенные химические вещества или конкретные химические реакции. Окрашивание In-vitro включает окрашивание клеток или структур, которые были удалены из их биологического контекста. Некоторые окраски часто комбинируют, чтобы выявить больше деталей и особенностей, чем одно окрашивание может выявить по отдельности, а контрастное окрашивание — это окрашивание, которое увеличивает видимость клеток или структур, когда основного окрашивания недостаточно. Ученые и врачи могут комбинировать окрашивание со специальными протоколами фиксации и подготовки образцов и могут использовать эти стандартные методы в качестве последовательных, воспроизводимых диагностических инструментов.

Существует невероятное количество красителей, которые можно использовать самыми разными способами. Ниже приведены некоторые общие аспекты процесса подготовки к окрашиванию in-vitro .

• Фиксация: Само по себе это может состоять из нескольких шагов. Фиксация направлена ​​на то, чтобы максимально сохранить форму клеток (в данном случае микробов). Иногда используется тепловая фиксация, чтобы убить, склеить и изменить клетки, чтобы они принимали пятна. Большинство химических фиксаторов создают химические связи между белками и другими веществами в образце, увеличивая их жесткость. Обычные фиксаторы включают формальдегид, этанол, метанол и пикриновую кислоту.
• Пермеабилизация: включает обработку клеток (обычно) мягким поверхностно-активным веществом. Эта обработка растворяет клеточные мембраны, позволяя более крупным молекулам красителя проникать внутрь клетки.
• Крепление: этот этап обычно включает в себя прикрепление образцов к предметному стеклу микроскопа для наблюдения и анализа. В некоторых случаях клетки можно выращивать прямо на предметном стекле. Образцы свободных клеток можно наносить непосредственно на предметное стекло.

В самом простом случае процесс окрашивания может включать погружение образца (до или после фиксации и заливки) в раствор красителя с последующим ополаскиванием и наблюдением. Однако многие красители требуют использования протравы — химического соединения, которое вступает в реакцию с пятном с образованием нерастворимого цветного осадка. Когда излишки раствора красителя смываются, протравное пятно остается. На этом этапе можно использовать невероятный набор красителей, от тех, которые окрашивают определенные типы микробов (см. рисунок ниже), до тех, которые выделяют субкомпартменты или органеллы клетки, такие как ядро ​​или эндоплазматический ретикулум. В качестве альтернативы можно использовать негативное окрашивание. Это простой метод окрашивания бактерий, который заключается в нанесении клеток на предметное стекло с последующим нанесением нигрозина (черный синтетический краситель) или туши (водная суспензия углеродных частиц). После высыхания микроорганизмы можно рассматривать в светлопольной микроскопии, так как более светлые включения хорошо контрастируют с окружающей их темной средой

Рисунок: Окраска хламидий : Клетки бактериального возбудителя хламидий (указаны стрелками) выделены окраской под названием «геймза. «

Живой, in-vivo Окрашивающая микроскопия во многом повторяет эти этапы, за исключением фиксации, которая неизменно убивает исследуемый микроб.

Ключевые моменты

• Окрашивание in vivo, которое визуализирует живые клетки, и окрашивание in vitro, которое визуализирует фиксированные клетки, имеют важное применение.
• Существует широкий спектр красителей, которые можно использовать для микробов, которые могут выделить почти любую характеристику клетки, даже органеллы внутри клетки.

Протоколы окрашивания

• могут быть сложными, но в них есть несколько основных этапов: подготовка, фиксация, окрашивание и монтаж.

Ключевые термины

• поверхностно-активное вещество : поверхностно-активный агент или смачивающий агент, способный снижать поверхностное натяжение жидкости; обычно органические соединения, имеющие гидрофильную «голову» и гидрофобный «хвост»
• органелла : специализированная структура, находящаяся внутри клетки, которая осуществляет определенный жизненный процесс (например, рибосомы, вакуоли)

ЛИЦЕНЗИИ И ПРАВА АВТОРСТВА

CC ЛИЦЕНЗИОННОЕ СОДЕРЖИМОЕ, ​​КОНКРЕТНОЕ АВТОРСТВО

• Колледж OpenStax, биология. 16 октября 2013 г. Предоставлено : OpenStax CNX. Расположен по адресу : http://cnx.org/content/m44405/latest…ol11448/latest. Лицензия : CC BY: Attribution
• электрон. Предоставлено : Викисловарь. Расположен по адресу : en.wiktionary.org/wiki/electron. Лицензия : CC BY-SA: Attribution-ShareAlike

Разрешение

• . Предоставлено : Викисловарь. Расположен по адресу : en.wiktionary.org/wiki/resolution. Лицензия : CC BY-SA: Attribution-ShareAlike
• Колледж OpenStax, изучение клеток. 16 октября 2013 г. Предоставлено : OpenStax CNX. Расположен по адресу : http://cnx.org/content/m44405/latest…1_01ab_new.jpg. Лицензия : CC BY: Attribution
• Окрашивание. Предоставлено : Википедия. Расположен по адресу : en.Wikipedia.org/wiki/Staining. Лицензия : CC BY-SA: Attribution-ShareAlike
• Окрашивание. Предоставлено : Википедия. Расположен по адресу : en.Wikipedia.org/wiki/Staining. Лицензия : CC BY-SA: Attribution-ShareAlike
• Окрашивание. Предоставлено : Википедия. Расположен по адресу : en.Wikipedia.org/wiki/Staining. Лицензия : CC BY-SA: Attribution-ShareAlike
• органелла. Предоставлено : Викисловарь. Расположен по адресу : en.wiktionary.org/wiki/organelle. Лицензия : CC BY-SA: Attribution-ShareAlike
• поверхностно-активное вещество. Предоставлено : Викисловарь. Расположен по адресу : en.wiktionary.org/wiki/surfactant. Лицензия : CC BY-SA: Attribution-ShareAlike
• Колледж OpenStax, изучение клеток. 16 октября 2013 г. Предоставлено : OpenStax CNX. Расположен по адресу : http://cnx.org/content/m44405/latest…1_01ab_new.jpg. Лицензия : CC BY: Attribution
• Окрашивание хламидий Геймзы CDC. Предоставлено : Wikimedia. Расположен по адресу : commons.wikimedia.org/wiki/Fi…_Stain_CDC.jpg. Лицензия : Общественное достояние: Авторские права неизвестны

Эта страница под названием 3.2B: Общие методы окрашивания распространяется под лицензией CC BY-SA 4.0 и была создана, изменена и/или курирована компанией Boundless.

1. Наверх

• Была ли эта статья полезной?

1. Тип изделия

   Раздел или страница

   Автор

   Безграничный

   Лицензия

   CC BY-SA

   Версия лицензии

   4,0

   Показать оглавление

   нет

2. Теги

   1. Крепление
   2. Крепление
   3. Пермеабилизация
   4. окрашивание

Методы дифференциального окрашивания – микробиология: лабораторный опыт

Просмотр бактериальных клеток

Микроскоп является очень важным инструментом в микробиологии, но существуют ограничения, когда дело доходит до его использования для наблюдения за клетками вообще и бактериальными клетками в частности. Двумя наиболее важными проблемами являются разрешение и контрастность. Разрешение — это ограничение, с которым мы ничего не можем поделать, поскольку большинство бактериальных клеток уже приближаются к пределу разрешения большинства световых микроскопов. Контраст, однако, можно улучшить либо с помощью оптической системы другого типа, такой как фазово-контрастный или дифференциально-интерференционно-контрастный микроскоп, либо путем окрашивания клеток (или фона) хромогенным красителем, который не только добавляет контраст, но и дает им тоже цвет.

В микробиологии используется множество различных красителей и процедур окрашивания. Некоторые из них включают одно окрашивание и всего несколько шагов, в то время как другие используют несколько окрашиваний и более сложную процедуру. Прежде чем приступить к процедуре окрашивания, клетки необходимо смонтировать (размазать) и зафиксировать на предметном стекле.

Бактериальный мазок — это просто небольшое количество культуры, нанесенное очень тонкой пленкой на поверхность предметного стекла. Чтобы предотвратить вымывание бактерий на этапах окрашивания, мазок можно химически или физически «фиксировать» на поверхности предметного стекла. Термофиксация — это простой и эффективный метод, который достигается путем кратковременного пропускания предметного стекла через пламя горелки Бунзена, в результате чего биологический материал более или менее постоянно прикрепляется к поверхности стекла.

Мазки, зафиксированные нагреванием, готовы к окрашиванию. При простом окрашивании к мазку добавляются красители, которые либо притягиваются за счет заряда (катионный краситель, такой как метиленовый синий или кристаллический фиолетовый), либо отталкиваются за счет заряда (анионный краситель, такой как эозин или тушь). Катионные красители связывают бактериальные клетки, что хорошо видно на ярком фоне. Анионные красители отталкиваются клетками, поэтому клетки ярко светятся на окрашенном фоне. См. рисунки 1 и 2 для примеров обоих.

Рисунок 1. Отрицательное окрашивание Cyptococcus neoformans , инкапсулированных дрожжей. Рисунок 2. Положительное окрашивание Staphylococcus aureus.

Вероятно, наиболее важной особенностью, которая становится очевидной при окрашивании бактериальных клеток, является их клеточная морфология (не путать с колониальной морфологией, которая представляет собой появление бактериальных колоний на чашке с агаром). Большинство гетеротрофных и культивируемых бактерий имеют несколько основных форм: сферические клетки (кокки/кокки), палочковидные клетки (бациллы/бациллы) или палочковидные клетки с изгибами или изгибами (вибрионы и спириллы соответственно). Существует большее разнообразие форм среди архей и других бактерий, обитающих в экосистемах, отличных от человеческого тела.

Часто бактерии создают специфические устройства клеток, которые формируются в результате бинарного деления бактериями по мере их размножения. Механизмы особенно очевидны для неподвижных бактерий, потому что клетки имеют тенденцию оставаться вместе после завершения процесса деления. И форма, и расположение клеток являются характеристиками, по которым можно различать бактерии. Наиболее часто встречающиеся формы бактерий (кокки и бациллы) и их возможное расположение показаны на рисунках 3 и 4.

Рисунок 3. Возможное расположение бактериальных клеток кокков.
Рисунок 4. Возможное расположение бактериальных клеток для бацилл

Дифференциальные методы окрашивания

В микробиологии методы дифференциального окрашивания используются чаще, чем простое окрашивание, как средство сбора информации о бактериях. Методы дифференциального окрашивания, которые обычно требуют более одного окрашивания и нескольких стадий, называются таковыми, потому что они позволяют дифференцировать типы клеток или клеточные структуры. Наиболее важным из них является окраска по Граму. Другие методы дифференциального окрашивания включают окрашивание эндоспор (для выявления бактерий, образующих эндоспоры), кислотоустойчивое окрашивание (для различения Mycobacterium из других бактерий), метахроматическое окрашивание для выявления гранул запаса фосфата и окрашивание капсулы (для выявления инкапсулированных бактерий). Мы будем выполнять процедуры окрашивания по Граму и окрашивание эндоспор в лаборатории, а также просматривать подготовленные слайды, которые подчеркивают некоторые другие клеточные структуры, присутствующие в некоторых бактериях.

Окрашивание по Граму

Рисунок 5. Бактерии, окрашенные по Граму.

В 1884 году врач Ганс Христиан Грам изучал этиологию (причину) респираторных заболеваний, таких как пневмония. Он разработал процедуру окрашивания, которая позволила ему идентифицировать бактерию в легочной ткани, взятой у умерших пациентов, как этиологический агент фатальной пневмонии. Хотя метод окрашивания по Граму мало помог в лечении болезни, метод окрашивания по Граму значительно облегчил диагностику причины смерти человека при вскрытии. Сегодня мы используем методы окрашивания по Граму, чтобы облегчить идентификацию бактерий, начиная с предварительной классификации в одну из двух групп:  Грамположительные или Грамотрицательные .

Дифференциальный характер окраски по Граму основан на способности некоторых бактериальных клеток сохранять первичную окраску (кристаллический фиолетовый), сопротивляясь процессу обесцвечивания. Окрашивание по Граму включает четыре этапа. Сначала клетки окрашивают кристаллическим фиолетовым, а затем добавляют закрепитель красителя (йод). Затем применяется спирт, который избирательно удаляет окраску только с грамотрицательных клеток. Наконец, добавляется вторичный краситель, сафранин, который контрастно окрашивает обесцвеченные клетки в розовый цвет.

Хотя Грам в то время этого не знал, основное различие между этими двумя типами бактериальных клеток заключается в их клеточных стенках. Стенки грамотрицательных клеток имеют внешнюю мембрану (также называемую оболочкой), которая растворяется во время промывки спиртом. Это позволяет кристаллическому фиолетовому красителю уйти. Только обесцвеченные клетки поглощают розовый краситель сафранин, что объясняет разницу в цвете между двумя типами клеток. По завершении процедуры окрашивания по Граму грамположительные клетки становятся фиолетовыми, а грамотрицательные — розовыми.

При интерпретации окрашенного по Граму мазка необходимо также описать морфологию (форму) клеток и их расположение. На рисунке 5 представлены два различных типа бактерий, которые можно различить по реакции окрашивания по Граму, а также по их форме и расположению. Ниже опишите эти характеристики для обеих бактерий:

Кислотостойкий краситель

Некоторые бактерии производят восковидное вещество миколовую кислоту , когда они строят свои клеточные стенки. Миколевая кислота действует как барьер, защищая клетки от обезвоживания, а также от фагоцитоза клетками иммунной системы хозяина. Этот восковой барьер также предотвращает проникновение красителей в клетку, поэтому окрашивание по Граму не работает с микобактериями, такими как Mycobacterium , которые являются патогенами человека и животных. Для этих бактерий используется метод кислотного окрашивания – быстрого окрашивания .

Рисунок 6. Кислотоустойчивые палочки в мокроте

Для выполнения кислотостойкой окраски термофиксированный мазок заливают первичным красителем карбол-фуксин, а предметное стекло нагревают на водяной бане с водяным паром. Тепло «плавит» восковую клеточную стенку и позволяет клеткам поглощать краситель. Затем предметному стеклу дают остыть и добавляют раствор кислоты и спирта в качестве обесцвечивателя. Клетки, которые являются «кислотостойкими» из-за миколовой кислоты в их клеточной стенке, сопротивляются обесцвечиванию и сохраняют первичное окрашивание. Все остальные типы клеток будут обесцвечены. Затем в качестве контрастного красителя используется метиленовый синий. В конце концов, кислотоустойчивые бактерии (КУБ) будут окрашены в ярко-розовый цвет, а все остальные типы клеток будут казаться голубыми.

Методы окрашивания для выделения специфических клеточных структур

Капсула : полисахаридная слизь, которая окружает некоторые виды бактерий и несколько типов эукариотических микробов, лучше всего визуализируется при отрицательном окрашивании клеток. В этом методе бактерии сначала смешивают с красителем, а затем каплю смеси распределяют по поверхности предметного стекла тонкой пленкой. При использовании этого метода капсулы выглядят как прозрачный слой вокруг бактериальных клеток с темным фоном.

Metachromatic Гранулы или другие . Одним из примеров является грамположительная бацилла Corynebacterium , которая хранит фосфат в структурах, называемых «волютин» или метахроматических гранулах, которые находятся внутри клеточной мембраны. Различные методы окрашивания используются для визуализации внутрицитоплазматических телец у бактерий, которые часто дают ключ к идентификации при наблюдении в клетках.

Окрашивание эндоспор

Эндоспоры — это спящие формы живых бактерий, и их не следует путать с репродуктивными спорами, вырабатываемыми грибами. Эти структуры производятся несколькими родами грамположительных бактерий, почти всеми бациллами, в ответ на неблагоприятные условия окружающей среды. Двумя распространенными бактериями, которые производят эндоспоры, являются Bacillus или Clostridum . Оба живут в основном в почве и как симбионты растений и животных и производят эндоспоры, чтобы выжить в среде, которая быстро и часто меняется.

Процесс эндоспоруляции (образование эндоспор) включает несколько стадий. После того, как бактериальная клетка реплицирует свою ДНК, образуются слои пептидогликана и белка, окружающие генетический материал. После полного формирования эндоспора высвобождается из клетки и может находиться в состоянии покоя в течение нескольких дней, недель или лет. Когда преобладают более благоприятные условия окружающей среды, эндоспоры прорастают и возвращаются к активной деятельности в качестве вегетативных клеток.

Зрелые эндоспоры обладают высокой устойчивостью к условиям окружающей среды, таким как тепло и химические вещества, что позволяет бактериям выживать в течение очень длительного периода времени. Эндоспоры, образовавшиеся миллионы лет назад, были успешно возвращены к жизни, просто обеспечив их водой и пищей.

Поскольку оболочка эндоспор очень устойчива к окрашиванию, был разработан специальный метод, чтобы их было легче увидеть в светлопольном микроскопе. Этот метод, называемый окрашиванием эндоспор , использует либо тепло, либо длительное время воздействия, чтобы побудить эндоспоры принять первичный краситель, обычно водорастворимый краситель, такой как малахитовый зеленый, поскольку эндоспоры проницаемы для воды. После этапа обесцвечивания, при котором краситель удаляется из вегетативных клеток в мазке, применяется контрастное окрашивание сафранином для придания цвета и контраста. При окрашивании этим методом эндоспоры становятся зелеными, а вегетативные клетки окрашиваются в розовый цвет, как показано на рис. 7.9.0032
Рисунок 7. Бактериальные клетки с эндоспорами, окрашенные красителем для эндоспор. Рисунок 8. Бациллы с эндоспорами при фазово-контрастной микроскопии.

Хотя сами эндоспоры устойчивы к окрашиванию по Граму, бактериальные клетки, захваченные в процессе создания этих структур, могут быть окрашены. В этом случае эндоспоры видны как четкие овальные или сферические участки внутри окрашенной клетки. Эндоспоры также можно непосредственно наблюдать в клетках с помощью фазово-контрастной микроскопии, как показано на рис. 8.9.0032

Поскольку многие методы дифференциального окрашивания требуют нескольких этапов и занимают много времени, мы не будем использовать все описанные выше методы дифференциального окрашивания.

Предварительно окрашенные предметные стекла

будут использоваться для визуализации бактериальных капсул, метахроматических гранул и кислотоустойчивых бацилл. Получите по одному предметному стеклу каждой из трех бактерий, перечисленных в таблице ниже. Просматривая эти слайды, обратите внимание на «выделенные» структуры. Ваш изолят из окружающей среды может иметь одну или несколько из этих клеточных особенностей, и научиться их распознавать поможет в идентификации. Все это следует рассматривать с помощью масляного иммерсионного объектива.

Окраска по Граму

Все процедуры окрашивания следует проводить над раковиной. Будет продемонстрирована процедура окрашивания по Граму, а обзор представлен в таблице 1.

Доброволец с вашего лабораторного стола должен получить культуры бактерий, которые вы будете использовать в этой лаборатории, в соответствии с указаниями вашего инструктора. Одна из культур будет грамположительной бактерией, а другая — грамотрицательной. Ниже напишите названия бактерий, которые вы будете использовать, вместе с BSL для каждой культуры:

________________________________________________________________________________________________

Возьмите два предметных стекла и приготовьте мазок каждой из двух бактериальных культур, по одной на предметное стекло, как показано. Дать ПОЛНОСТЬЮ высохнуть на воздухе и зафиксировать теплом. Оба мазка окрасить по Граму. Рассмотрите слайды с помощью светового микроскопа с увеличением в 1000 раз и запишите свои наблюдения в таблицу ниже.

Окраска по Граму «Окончательный осмотр»: приготовьте мазок, содержащий смесь грамположительных и грамотрицательных бактерий, добавив небольшое количество каждой бактерии в одну каплю воды на предметном стекле. Нагревание фиксирует мазок и окрашивает его по Граму. Вы должны быть в состоянии определить реакцию окрашивания по Граму, клеточную морфологию и расположение ОБЕИХ бактерий в этом смешанном мазке. Ваш преподаватель может попросить показать этот слайд и предложить конструктивный комментарий.

Окрашивание эндоспор

Лишь несколько родов бактерий продуцируют эндоспоры, и почти все они являются грамположительными бациллами. Наиболее примечательны виды Bacillus и Clostridium , которые естественным образом обитают в почве и часто загрязняют поверхности. Рост Clostridium spp. обычно ограничивается анаэробной средой; Bacillus spp. могут расти аэробно и анаэробно. Эндоспорообразующие бактерии отличаются от других групп грамположительных бацилл и отличаются своими эндоспорами.

Обзор процедуры окрашивания эндоспор представлен в таблице 2.

После окрашивания эндоспоры обычно выглядят как светло-зеленые овальные или сферические структуры, которые можно увидеть либо внутри, либо снаружи вегетативных клеток, которые кажутся розовыми.

Форма и расположение эндоспор внутри бактериальных клеток, а также то, расширяет ли спорангий (D) или не расширяет (ND) стороны клетки, являются важными характеристиками, которые помогают различать виды (см. рис. 9).).

Рисунок 9

1. Овальный, центральный, не расширенный (ND)
2. Овальный, терминальный, ND (и параспоральный кристалл)
3. Овальный, концевой, расширенный (D)
4. Овальный, центральный, D
5. Сферический, концевой, D
6. Овальный, боковой, D

Эндоспоры достаточно устойчивы к большинству процедур окрашивания; однако в обычно окрашенном мазке они могут быть видны как «очертания» с чистым пространством внутри. Если вы наблюдаете «очертания» или то, что кажется «призраками» клеток в окрашенном по Граму мазке грамположительных бацилл, то следует также провести окрашивание эндоспор, чтобы подтвердить наличие или отсутствие эндоспор.

Доброволец с вашего лабораторного стола должен получить бактериальные культуры для окрашивания эндоспор в соответствии с указаниями вашего инструктора.