Стойкая крем-краска для волос MATRIX Socolor.beauty — «Что выбрать: цвет или качество волос? Я выбираю и то и другое! MATRIX Socolor. beauty в оттенке 5AV светлый шатен пепельно-перламутровый. А также оттенок 6sp темный блондин серебристый перламутровый на волосы после смывки с темного. »

Приветствую!

Раньше я уже делилась отзывом о моей любимой краске Igora Royal, но, к сожалению, в наличии моего оттенка не было в магазине. В итоге, по совету консультанта, обратила внимание на стойкую крем-краску для волос MATRIX Socolor.beauty в оттенке 5AV светлый шатен пепельно-перламутровый.

✔️Описание:

Краситель, как и остальные представители профессиональной продукции, продаются отдельно от оксида. Сама красящая эмульсия выпускается в алюминиевой тубе объёмом 90 мл, к которой отдельно приобретается необходимый оксид, в моем случае — 3%. Соотношение красителя/активатора составляет 1:1.

Сама коробочка краски цвета фуксии, очень такая позитивная и девчачья.

В коробочке располагается сам тюбик краски и инструкция по применению. В инструкции, как и положено, особенное внимание уделяют тесту на наличие аллергии к продукту.

✔️Применение и впечатления:

При смешивании с активатором, краска становится консистенции жирной сметаны. Это такая средней вязкозти субстанция, визуально кажущаяся маслянистой. Консистенция похожа на Estel Professional De Luxe. Что мне не понравилось уже на этапе смешивания — это резкий аммиачный запах. Он намного выраженнее, чем у Igora, которой я привыкла пользоваться. Первые пары бьют по обонянию и раздражают слизистые глаз, но потом то ли привыкаешь к этому запаху, то ли он улетучивается, что в использовании он уже не такой ядерный.

Чем меня порадовала краска, так это объёмом! Если просто покрасить корни, то ее хватит на 2 применения, а если на всю длину, мне хватило одного тюбика! Уж очень это удобно и экономно! Пусть MATRIX и стоит дороже Igora, но по факту окрашивание получается дешевле, потому что хватает одного тюбика.

В неметаллической мисочке я смешала компоненты краски и добавила еще зеленый корректор цвета и капельку пепельного, потому что мне необходимо дополнительно нейтрализовать красноту, которая вылезает во всей красе после вымывания красителя из волос и придать дополнительную холодность, которую я люблю. Имейте в виду, что при использовании пепельного корректора, можно занизить уровень тона и итог получится темнее., поэтому, если вам не нужен такой эффект, используйте умеренно.

Краску нанесла на всю длину, так как пигмент подвымылся и выждала, согласно инструкции, 35 минут.

По истечении времени выдержки, смыла краску прохладной водой, вымыла голову шампунем для окрашенных волос, нанесла бальзам и когда уже ополаскивала волосы, заметила до чего же они гладкие.

После сушки феном я заметила, что волосы стали заметно темнее. Цвет получился холодным каштановым на свету , как я люблю, а в тени и при холодном искуственном освещении почти черный, но с перламутровым переливом.

Образец и результат на моих волосах

Если посмотреть заявленный цвет и итоговый, то все соответствует. Безусловно, необходимо помнить, что важную роль играет исходный уровень тона.

Корни, при дневном освещении

Качество волос, о нем хочется сказать отдельно. Волосы очень гладкие и мягкие на ощупь. Они живые и лоснятся, обожаю такой эффект!

При дневном освещении виден холодный каштан

Волосы мягкие и шелковистые

Аромат от красителя присутсвует до следующего мытья и очень похож на бальзам в краске L’oreal Casting, которым я когда-то давно пользовалась.

Обновление:

После смывки и декапирования, сделала окрашивание оттенком 6sp с добавлением антижелтого корректора. Хоть и заявленный оттенок относится к холодной гамме, получился более теплый с золотинкой. Но, рыже-желтый фон осветления сложно с первого раза перекрыть

✔️Итог:

Краска MATRIX Socolor.beauty — это находка и очень достойный краситель. Если честно, подумываю даже пользоваться именно ей, а не Igora, потому что удобно покупать один тюбик краски, если я не стремлюсь к сложному цвету. Качество волос меня радует, ну и стойкость красителя уже не обсуждается. Единственный минус — это резкий запах аммиака, в остальном все отлично! Поэтому даже звезду снимать не буду, потому что плюсы перекрывают этот незначительный минус.

Спасибо за внимание!

Мой опыт окрашивания и ухода за волосами продуктами Matrix | Отзывы покупателей

Всем приветики! Этот пост я хотела написать ещё в сентябре, но решила подождать, чтобы мнение об описываемых мной продуктах было объективным. Кто думает, окрашивать волосы или нет, кто хочет перемен во внешности и не знает, с чего начать, прошу под кат.

Предыстория. На протяжении трёх-четырёх лет меня периодически посещали мысли об окрашивании волос, но в силу обстоятельств и некоторой приверженности к натуральному уходу, они у меня как-то быстро рассеивались. Практически у любой женщины в жизни случаются моменты, когда как в песне «перемен требуют наши сердца». В августе 2019 года не только мое сердце, но и ещё голова захотели смены образа. После взвешиваний всех «за» и «против» я отправилась в салон к своему мастеру.

Окрашивание. За неделю перед ним сделали ухаживающую стрижку, убрали сухие концы. Краситель использовался MATRIX Color Sync без аммиака. Стойкое окрашивание мной пока не рассматривается.

Что могу сказать о нем. Достаточно жидкий, вонючий в меру. На мою длину ушло два тюбика, если волос пористый, может понадобиться и три. Лучше предварительно волосы подпитать. Важно использовать родной окислитель и все же первую процедуру проводить в салоне, чтобы цвет был равномерным. Седину не закрасит, но эффекта камуфлирования добиться можно, впрочем от тонирования большего ждать нечего.

Результат окрашивания. Мне понравился. Волос стал блестящим, гладким, хорошо укладывается. Стойкость примерно 2-3 месяца, зависит от ухода и текстуры волос. Я обновляла через 2,5 месяца. В информации на официальном сайте марки говорится о сохранении эффекта тонирования после 20-24 раз использования шампуня при мытье. Оттенок точно не назову (помню что-то из «натуральной» палитры), потому что смешивалось несколько — первый раз холоднее брали, второй — теплее.

Щадящее окрашивание

Блеск

Гладкость

Большая палитра

Красивые оттенки

Цена

Не закрашивает седину

Нельзя подкрашивать корни волос при отрастании

БылоСталоБылоСтало

Немного о стойкости.

На данный момент (на фотографии ниже) после крайнего окрашивания прошло 2 месяца. Волосы отросли примерно на 4 см, граница цвета заметна при прямом падении света, но резкий переход не виден. Если оттенок подобрать в тон можно, мне кажется, и больше трёх месяцев не обновлять.

Цена: 450-500р. за тюбик.

Оценка: 5.

Срок использования: 5 месяцев (2 окрашивания).

Уход. Для себя решила, что уходовые средства будут также от Matrix. Попробовала две их линейки Biolage и Color Obsessed, которые оставили достаточно хорошие впечатления.

MATRIX Color Obsessed Shampoo.

Аромат у него ненавязчивый, расход средний, волосы промывает хорошо, но не до скрипа. Текстура кремовая, не тяжёлая. С продуктами серии Color Obsessed не обновляла цвет 2,5 месяца. Единственное, что могу назвать недостатком — то, что по моим ощущениям, волосы пачкались быстрее и приходилось мыть чаще, хотя это субъективно, потому что было тёплое время года.

Цена: 500-600р.

Оценка: 4.

Срок использования: 2,5 месяца.

MATRIX Color Obsessed Conditioner.

В пару к шампуню взяла и кондиционер.

Текстура у него не жирная, аромат косметический легкий, на волосах остаётся не долго, распределяется по длине без проблем. Для меня главное в кондиционере — это расчёсывание без спутывания. С этой задачей он справляется отлично. Волосы после его применения становятся мягкими, укладываются и сушатся феном хорошо.

Расход экономичный.

Цена: 600р.

Оценка: 5.

Срок использования: 3 месяца.

MATRIX BIOLAGE COLORLAST Shampoo.

Текстура шампуня средней жидкости, аромат цветочный ненавязчивый, пенится хорошо, промывает отлично, может подсушить тонкие и сухие волосы. С ним волосы мыла реже, чем с предыдущим. После его использования волосы блестящие. Расход средний. Цена у этой серии кусается, поэтому в раздумьях о повторе покупки, буду искать по акциям.

Цена: 700-800р.

Оценка: 5.

Срок использования 2 месяца.

MATRIX Biolage Keratindose Pro Keratin Conditioner.

Так как к шампуню кондиционер родной найти не получилось, то взяла этот.

Текстура у него жидковатая для кондиционера, из-за чего расход большой. Может утекать с волос и рук. Аромат также ненавязчивый. Волосы после него расчёсываются хорошо, не утяжеляет, разглаживает. Для глубокого восстановления не подойдёт. Супер эффекта не заметила.

Цена: 800-900р.

Оценка: между 3 и 4, скорее 4-

Срок использования: 2 месяца.

В целом, у меня осталось приятное впечатление от средств Matrix и скорее всего продолжу их использование, единственное, только шампунь Biolage с родным кондиционером для окрашенных волос. Был ли у вас опыт окрашивания и ухода продуктами этой марки? Буду рада общению в комментариях.

Меня зовут Даша, со мной на «ты».

фото, отзывы (Натуральные оттенки Matrix SoColor) :: bright-hair.ru

Краска для волос Matrix SoColor использует специальную технологию ColorGrip, которая позволяет добиться идеального цвета и обеспечивает отличное закрашивание седины надолго. Кондиционирующий комплекс Cera Oil ухаживает и питает волосы, укрепляет и выравнивает их.

Краска для волос Matrix SoColor 10AV

Очень широкая палитра оттенков позволит создать нужный цвет со всеми нюансами. Краска очень легко смешивается и наносится.

Краска для волос Матрикс СоКолор 10AV Очень-очень светлый блондин пепельно-перламутровый, как и палитра профессиональной краски Matrix, использует новейшую технологию окрашивания маслом для создания умопомрачительного цвета. Одна из лучших разработок Matrix для окрашивания волос.

Обратите также внимание и на другие оттенки краски:

Советы по окрашиванию волос

При окрашивании дома накиньте полотенце или рубашку на плечи, чтобы на одежде не осталось пятен от краски. Также стоит нанести слой жирного крема у линии роста волос для защиты кожи от окрашивания.

Всегда используйте восстанавливающие средства, если волосы сильно повреждены. Для этого подойдут специальные составы с маслами, протеином, жидким кератином.

Как правильно делать укладку

Насадка-концентратор позволяет концентрировать поток воздуха на отдельных прядях, это помогает ускорить процесс сушки. Насадка-диффузор используется для укладки кудрявых волос.

Если у вас редкие волосы, то при создании объемной прически не используйте слишком много средства для укладки. Все они утяжеляют волосы и могут создать противоположный эффект!

КОЛОРИСТКА » Краска для волос Matrix, палитра, инструкция

Краска для волос Matrix, профессиональное средство для окрашивания появилось на рынке более 30 лет назад. За это время они снискали популярность у широкого круга стилистов. Наиболее известные линейки этого бренда — Matrix Сolor Sync без аммиака, Color Sync Extra Coverage для седых волос, Socolor Beauty ухаживающая краска, Matrix Light Master для осветления.

Краска для волос Matrix имеет широкую палитру оттенков, отлично ложится на волосы и обеспечивает стойкий результат окрашивания, проникая глубоко внутрь волоса и надежно закрепляя там цветовой пигмент.

Краска для волос Matrix- типы красителей

Линейка красок для волос Матрикс, представлена широким разнообразием красок, делится на шесть категорий:

• Demi-Permanent -Деми перманентная (тонирующая краска)
• Grey Coverage— Краска для покрытия седины
• Lightener— Средства для осветления
• Permanent-Перманентная или стойка краска
• Semi-Permanent-Семи перманентная (краситель средней стойкости)

Деми перманентная краска Матрикс

Входят следующие линейки средств для окрашивания:

• SOCOLOR CULT-Краска для насыщенного цвета представлена широкой палитрой оттенков. (Подходит также для седых волос и для смешивания с другими красками линеек Матрикс)
• Color Sync Ammonia-Free Demi-Color— Тонирующая краска с удвоенным содержанием керамидов.

Color Sync Ammonia-Free Demi-Color

• Gloss Sync- Блестящие стойкие оттенки, которые не темнеют

Палитра Gloss Sync

Краска для седых волос

SoColor — Стойкая краска, с комплексом Cera-Oil.

Осветлители Матрикс

• Light Master— Система осветления волос, которая предлагает индивидуальный поход к окрашиванию в блондин, эффектное осветление.
• LightInsider Lightening System— Осветление в максимально чистый блонд, поднятие на шесть уровней

Стойкое окрашивание Матрикс

• Logics Color DNA System -Краска для волос с технологией двойного действия, с усиленная питательной формулой (питает каждую прядь), восстанавливает повреждения, придает блеск и шелковистость.

• SoBoost -Для стойкого окрашивания. Можно смешивать с коллекциями SoColor и ColorSync для создания мягких пастельных тонов или усиления цвета, также подходит для яркого тонирования после предварительного осветления.

• SOCOLOR CULT— Яркий цвет волос в обширной палитре оттенков.

• ColorInsider— Стойкое окрашивание для максимального результата с минимальным повреждением кутикулы волос.

ColorInsider

Семи перманентная (краситель средней стойкости) от Матрикс

• Color Graphics Lacquer-Полупостоянные оттенки, которые можно наносить в качестве самостоятельного красителя или смешивать для получения бесконечной палитры, от чистых тонов до пастельных оттенков.

Краска для волос Matrix состав

В красках Matrix, аммиак или не содержится совсем или присутствует в минимальных дозах, упор сделан на ухаживающие компоненты.

• Керамиды R способствуют предотвращению окисления и потери влаги. Защищают кожу головы от неблагоприятного воздействия химических веществ, и кроме того, склеивают чешуйки волос, что придает им дополнительное сияние и прочность.
• Цветовые пигменты, приближенные по составу к натуральным, проникают глубоко внутрь волоса, благодаря чему долго сохраняется цвет.
• Ухаживающие растительные масла, такие как оливковое, жожоба и репейное, известны своими полезными свойствами.

Преимущества краски для волос Matrix

Профессиональные краски для волос Matrix имеют широчайший диапазон оттенков, начиная с естественных, почти натуральных оттенков блонд с легким жемчужным сиянием, до глубоких медных и коричневых. Кроме того, они обеспечивают равномерное окрашивание и сохраняют волосы здоровыми.

Недостатки краски для волос Matrix

Из минусов красок бренда Matrix можно выделить, наверное, лишь их стоимость. Однако, хоть они и дороже многих красок для домашнего окрашивания, среди профессиональных средств вполне конкурентоспособны.

• Если вы блондинка, то вам подойдет серия Matrix Ultra Blonde, насчитывающая в своей палитре 7 разных светлых оттенков — пепельных, перламутровых и натуральных, которые позволят добиться нужного результата даже при переходе из темно-русых волос за одно применение. Их также можно использовать для мелирования.
• Если вы брюнетка, то для кардинального осветления используйте Matrix Light Master, эта серия за 1 нанесение превратит вас в блондинку. Для ярких оттенков подойдет Matrix SoRED, в которой имеются цвета красно-медной гаммы, для натуральных — Matrix Сolor Sync

Краска для волос Matrix Инструкция по применению

• При первичном окрашивании необходимо смешать 2 части крем-краски с 1 частью оксиданта. Перемешать и нанести на сухие волосы. Выдержать 35-45 минут, затем смыть, используя шампунь и кондиционер.
• При повторном окрашивании, время выдерживания краски должно составлять около 30 минут на корнях волос. Затем краску нужно распределить равномерно по всей длине до самых кончиков и выждать еще 10-15 минут. Затем смыть.

Приведенная выше схема позволяет выравнивать и освежить цвет, придать ему дополнительное сияние.

В серии профессиональных красок для волос Matrix окислитель продается отдельно от крем-краски. Приведенная ниже шпаргалка поможет вам правильно его подобрать:

• 3-процентный окислитель подойдет, если вам необходимо окрасить волосы тон-в-тон или светлее на 1 уровень;
• 6-процентный – если осветлить необходимо на 2 уровня;
• 9-процентный подойдет для осветления волос на 3 уровня;
• 12-процентный для того, чтобы осветлить на 4-5 оттенков.

Меры предосторожности при использовании красок Matrix

Перед использованием краски необходимо протестировать кожу головы на чувствительность к компонентам. Если на коже появятся пятна или возникнет зуд – использовать нельзя. Руки при работе обязательно должны быть защищены перчатками. Запрещено использовать на волосах металлические заколки во время действия окислителя.

Результат окрашивания краски для волос Matrix

Если до окрашивания волосы зачастую выглядят безжизненными, тусклыми, имеются седые пряди, то окрашивание красками Matrix их преобразит. Локоны приобретут здоровый блеск, насыщенный сияющий цвет и шелковистость.

Для того, чтобы закрепить результат и сохранить его надолго, при мытье волос, необходимо использовать серию шампуней и кондиционеров, созданную специально для окрашенных или осветленных волос. Они помогут дольше сохранить пигмент внутри волоса и обеспечат должный уход.

Сколько держится цвет

После окрашивания профессиональной серией Matrix яркий насыщенный цвет будет радовать до 1 месяца.  Matrix  Socolor  Beauty отличаются невероятной стойкостью и при должном уходе сохраняют яркость и блеск продолжительное время

Отзывы стилистов о красках Matrix

Многие стилисты-колористы в своей работе остановились на красках Matrix, так как они позволяют получить желаемый оттенок просто и без сюрпризов. Кроме того, результат долго будет радовать клиента, а не смоется через несколько раз. Концерн L’Oreal купил этот бренд в 2005 году в качестве дочерней фирмы, а многие мастера считают L’Oreal гарантией качества.

Профессиональная краска для волос Matrix сможет удовлетворить запросы даже самых требовательных клиентов. Ее смело можно использовать при окрашивании в салонах красоты. Результат говорит сам за себя.

Краска для волос Matrix (Матрикс): палитра, особенности и разновидности

Красивая прическа – это залог привлекательности, но она требует существенных затрат времени и сил, кроме того, очень важно подобрать правильные косметические средства. Профессиональная краска для волос Matrix сегодня пользуется спросом не только среди стилистов, но и обычных женщин. Широкой популярности способствует не только высокое качество продукции бренда и огромный выбор цветов, но также безопасность и мягкое воздействие.

Появилась профессиональная краска для волос Матрикс благодаря американскому парикмахеру Анри Миллеру в 1980 году. Решение создать собственный бренд появилось из-за недостатка действительно качественных средств для реализации идей стилистов. Логическим продолжением этой линии для Анри стало также создание команды профессионалов в области парикмахерского искусства, которые наглядно демонстрируют, почему надо купить краску Matrix. Подобный подход позволил Миллеру занять почетное место на рынке средств для стайлинга, окрашивания и ухода за локонами. По данным компании, краску для волос Matrix купить можно более чем в пятидесяти странах мира, а специальные средства используются примерно в четверти миллиона салонов.

Краска Matrix Socolor Beauty

Средства для окрашивания волос сегодня очень популярны, поскольку с их помощью можно кардинально изменить имидж, но и далеко не все они дают ожидаемый результат. По этой причине стойкая крем-краска Matrix так востребована. Она обеспечивает глубокое окрашивание, а также придает обворожительный блеск.

Палитра краски для волос Матрикс Соколор включает в себя несколько десятков оттенков, в том числе и специальный бесцветный Clear, который нужен для модного пастельного окрашивания. Такой ассортимент позволяет подобрать оптимальный вариант на любой вкус: от мягких блондов до насыщенных каштановых и ярких красных тонов.

Выгодным преимуществом краски Матрикс Соколор является включение в состав специального комплекса Cera-Oil, который защищает и восстанавливает структуру волос. Не секрет, что во время покраски любым средством, даже самым бережным и щадящим, нарушается поверхностный слой. Такие нарушения структуры делают расчесывание болезненным, а также приводят к ломкости и сухости. Cera-Oil же надежно защищает локоны и восстанавливает мельчайшие повреждения.

Крем-краска Matrix Color Sync

Для того, чтобы окрашенные волосы долго сохраняли насыщенный оттенок и красивый блеск, не обязательно регулярно использовать стойкие средства. Содержащиеся в их составе компоненты при частом применении могут нанести существенный вред, привести к сухости и даже выпадению. Гораздо лучше воспользоваться тонирующей краской для волос Matrix Color Sync без аммиака, палитра которой включает множество оригинальных цветов. Она отлично ложится, делает оттенки ярче или насыщеннее, в зависимости от концентрации пигмента, что позволяет безопасно экспериментировать.

Краска Матрикс без аммиака также имеет еще одно интересное свойство: улучшать структуру волос, поскольку в состав входит особый керамидный комплекс. Он выравнивает поверхность, устраняя пористость и разглаживая микроскопические чешуйки. За счет этого существенно улучшается внешний вид, расчесывание и укладка становятся простыми и приятными. При помощи краски Матрикс Колор Синк можно реализовать самые оригинальные идеи, за что ее очень любят стилисты. Она идеально подходит для тонирования и мелирования. Интересными также являются необычные цветовые решения, такие как пастельные оттенки и металлик. Первые сегодня пользуются очень большим спросом, можно сказать, находятся на пике моды. Подобного эффекта можно также добиться с любым цветом палитры красок Матрикс за счет специального прозрачного крем-геля. Он как бы разбавляет состав, делая конечный результат на светлее. Металлики же придают невероятно яркий блеск, достичь которого можно только при помощи лаков с металлическими частицами, наносящими серьезный вред.

Краска Matrix для седых волос

И для женщин, и для мужчин седина – это серьезная проблема, которая способна испортить любой образ. Даже нескольких волосков в прическе достаточно, чтобы перечеркнуть результаты длительной процедуры укладки. Стоит справедливо отметить, что некоторым она идет, но только в тех случаях, когда проявляется равномерно. В остальных случаях на помощь приходит краска для седых волос Матрикс.

Выбрать правильный вариант довольно просто: и стойкая, и безаммиачная линии гарантируют закрашивание до пятидесяти процентов седины. В иных случаях стоит купить краску Матрикс для седых волос. Специально разработанная формула позволяет получить яркий равномерный цвет по всей длине.

Выбирая, какую краску Матрикс купить для решения проблемы седины, стоит оценивать ее масштабы. В тех случаях, когда серебристых прядей менее семидесяти процентов, а подвергать локоны воздействию стойких средств нежелательно, можно отдать предпочтение специальной линии Color Sync Extra Coverage. Она включает в себя шесть естественных оттенков, а также специальный комплекс растительных масел и керамидов, улучшающих структуру и устраняющих пористость. За счет этого, окрашивание превращается в полноценный уход за волосами.

Если седины больше, стоит обратить внимание на палитру цветов краски Matrix Socolor Beauty Dream Age. Она включает в себя шестнадцать естественных оттенков: от теплого золотистого блонда до насыщенного красно-коричневого. Особенностью этой линейки является специальный комплекс пигментов, которые придают многогранный мультирефлекторный блеск. За счет него оттенок выглядит максимально естественным: мерцающие полутона не вызовут даже мысли о том, что Ваши волосы окрашены. Кроме того, в красители входит особый ухаживающий комплекс с натуральными маслами Cera-Density. Он существенно снижает воздействие окислителей, а также исправляет структуру, придает гибкость, эластичность и жизненную силу.

Другая продукция Matrix

Одними красками и проявителями цвета Матрикс не ограничивается. Компания производит также широкий спектр товаров для стилистов, в частности, уникальные средства для стайлинга. Серия Vavoom позволяет реализовать самые смелые идеи, поскольку особый состав обеспечивает надежную и долговременную укладку, но не отягощает волосы. Невероятный объем не нарушает структуру прядей, а потому уложенные в прическу волосы выглядят еще более здоровыми и естественными, будто их никогда не касалась рука парикмахера.

Компания также выпускает высококачественные и эффективные средства для ухода. Особое место среди них занимает линейка BIOLAGE, которая используется для профессионального ухода и восстановления. В состав продуктов из этой серии входят природные комплексы керамидов, которые укрепляют и разглаживают поверхность каждого волоска, а также уникальные растительные экстракты, насыщающие витаминами и питательными веществами. Они идеально подходят для восстановления после экспериментов с окрашиванием и экстремальной укладкой, при которой применялись высокие температуры.

А линейка Total Results отлично подходит для применения в домашних условиях. Она включает в себя основные направления для решения наиболее распространенных проблем с волосами. Термозащитные бальзамы и шампуни образуют особую мембрану, которая надежно защищает при укладке с нагревом более двухсот градусов. Кроме того, они питают и отталкивают грязь. Средства для дополнительного объема создают эффект профессиональной укладки.

Восстанавливающая серия помогает решить проблему истонченных и поврежденных волос в домашних условиях. Она включает в себя как средства для ежедневного применения, так и маску для интенсивного ухода. А разглаживающие шампуни, масла и бальзамы позволяют исправить структуру, сделав расчесывание легким и приятным. В линейку также входят средства для окрашенных и седых волос, которые изготавливаются с учетом особенных требований.

Как и большинство товаров для профессиональных стилистов, продукция этого бренда не встречается на полках обычных магазинов и специализированных отделов супермаркетов. Но это не помешало миллионам покупателей оценить преимущества высококачественной американской косметики для волос, поскольку можно приобрести ухаживающие средства, расходные материалы и краску Матрикс в нашем интернет-магазине по доступным ценам.

У нас представлен широкий ассортимент продукции бренда Matrix, потому по выгодной цене можно приобрести купить не только краску, но и другие средства для волос. При этом, все товары гарантированно являются оригинальной косметикой, произведенной с учетом высоких стандартов качества.

Бесцветное тонирование Matrix Color Sync

Есть ли смысл с его помощью заполнять пигментом поврежденные волосы?

Приветствую всех. Данное тонирование я провела в рамках Марафона-6 и хочу поделиться своими результатами и выводами в отдельном посте, так как в итоговый марафонский это уже не помещается.

О бесцветном тонировании я задумывалась уже давно, но всё не решалась сделать. И причин тут было несколько: риск осветления на 0,5-1 тон, ухудшение состояния и без того поврежденных волос, поиск более “лечебных” средств (а не просто ламинирующих замазок).

Однако поиск таких средств особых плодов не дал. Такие процедуры как “Счастье для волос” от Lebel, кератиновое протезирование от Lanza, лечение волос REDKEN Chemistry даже в отливашках не так-то просто заполучить, а полные версии стоят уйму денег. Ходить в салоны на них еще убыточней, так как потребуется несколько процедур, и тогда проще купить полный набор и сделать дома.

Есть также псевдолечебные составы, такие как глазирование, ламинирование, но решила начать со знакомого — тонирования Matrix Color Sync — ведь этой краской я уже тонировалась 3 года назад ( тон 4, 5, мешали в салоне, точный “рецепт” не знаю).

О моих волосах

Итак, 2 года они без краски (после Matrix я еще тонировалась CONCEPT в салоне). И нижняя половина волос сейчас отличается по цвету, поврежденная, есть ломкость и много сечения по длине. Но я упорно ращу свой цвет.

Зачем мне это тонирование

Много читала, что беззаммиачным тонированием можно и нужно заполнять поврежденные волосы, ранее подвергавшиеся окрашиванию, пигментом.

Выбрала прозрачный оттенок, т.к. совсем не уверена, что смогу подобрать подходящий оттенок под свой цвет (надо бы поизучать это дело!). А ведь хочется чтобы цвет волосы был равномерный… Или уж тогда красивое омбрэ (что-то вдруг захотелось )

Но пока бесцветный — и только на поврежденную часть волос, так как я отращиваю свой цвет.

О тонировании

Состав:

Консистенция: у красителя — густая, нежно-бежевого цвета с жемчужным, у активатора — жидкая, непрозрасная, белого цвета

Аромат: при смешивании не было вообще, при нанесении на волосы стал проступать запах перекиси и усиливаться, и звучал еще сутки

Этапы тонирования

Подробную инструкцию именно к этому красителю нашла на просторах Интернета и следовала ей:

1. Вымыла голову ШГО (2 раза)
2. Промокнула волосы полотенцем, чтобы убрать лишнюю влагу
3. Влажные волосы разделила на 2 части, аккуратно расчесала редкой расческой
4. Приготовила смесь 1:1 (на свою длину и густоту взяла 15 гр красителя и 15 гр оксида)

Удобно, что есть такое деление на тюбике. Активатор отмеряла шприцем.

5. На влажные волосы нанесла смесь кистью — на поврежденную часть волос (в инструкции указано, что оттенок Clear наносится только на влажные волосы)
6. Оставила на 20 минут без применения тепла
7. Смыла с шампунем Кутрин для окрашенных волос, у меня оставалось немного от отливашки
8. Нанесла на 2 минуты кондиционер Кутрин Премиум увлажнение для окрашенных волос. Долго кружилась в магазине над бальзамом от Капус с pH 3,5 — как раз подходящий после окрашивания, но всё же удержалась от покупки (не знаю теперь зря или нет)
9. Смыла кондиционер, завернула волосы в полотенце, через 5 минут нанесла несмывашку Lanza
10. Высушила с профессиональным феном и термобрашингом с керамико-ионным покрытием. (Сначала подсушила без брашинга, затем попрядно с ним на средней мощности, после — холодным воздухом по всему полотну волос)

Мои впечатления

Самое первое впечатление — волосы как после хорошей маски: струятся, рассыпчатые, не утяжеленные, но плотные, сечение приглажено на 90%, при сушке с феном и термобрашингом приобретают шелковистость и податливость. После высыхания кончики приобрели долгожданную плотность (при этом оставаясь мягкими и упругими), однако лежали не так хорошо, как после ампулы Lakme или морфера с протеинами от того же Matrix. В целом, эффекты у этих трех продуктах похожий — но от ампулы больше увлажнения, а от морфера и тонировки — плотности.
Ожидала большего. От цветного тонирования был лучше эффект. Возможно, дело в темном пигменте. Но и сейчас немного заполнение “пустот” чувствуется.

И волосы со вспышкой — конечно, блеск потрясающий (но у меня так от любой хорошей маски, кондиционера).

И вот сравнение с другими средствами. На первом и втором фото — волосы высушены без брашинга (феном — только корни волос).

Через сутки после тонирования: блеск и мягкость остались, ни намека на сухость.
Через 2 недели: заметила, что электризоваться волосы стали больше обычного, но сухость не появилась.

Плюсы и минусы

Плюсы:

• не сушит волосы, даже волосы со средней поврежденностью
• экономичность
• немного уплотняет
• за один раз не изменил тон волос

Минусы:

• нужно использовать только “родной” окислитель
• процент оксида немаленький — 2,7%
• фасовка оксида только 1 л (но кому-то удавалось найти по 90 мл, мне — нет)
• при бесцветном тонировании эффект средний по сравнению с тонировкой темными оттенками.

Срок тестирования: 1 процедура
Оценка: 4- (предварительно)
Цена: краситель — 90 мл — 600 р, оксид 2,7% — 1000 мл — 700 р.
Куплю ли еще раз: вероятность мала, т.к. вариаций много, буду пробовать другие средства (да и этого тюбика мне его еще на 5 применений хватит). Но может, решусь на цветное тонирование от этого производителя (оксида-то много останется).

Общий вывод после 1 процедуры

Не вижу визуальной разницы в эффекте между тонировкой и морфером Matrix, так зачем “травить” волосики краской с оксидом, проще и лучше — только концентратом пользоваться. Но посмотрю как они проявят себя при многократном использовании.
Возможно, бесцветное тонирование подойдет больше тем, кто часто окрашивает волосы, а если они уже два года без краски — тут лучше делать восстановительные процедуры о которых я писала выше (Lanza, Lebel).

И самое главное — если волосы сильно повреждены, ломаются, секутся, тут не поможет ничего, только обрезать. И заполнить бесцветной тонировкой все прорехи не получится (как и “лечебными” средствами). Однако это поможет менее поврежденным волосам — тогда смысл в тонировании есть, но лучше сделать перед тонировкой восстанавливающие процедуры: кератиновое протезирование, морфер протеиновый от Матрикс. Я сделала морфер накануне тонирования. И в дальнейшем у меня был интенсивный уход, о котором подробно расскажу в итоговом посте к Марафону-6.

Благодарю всех за внимание. Красивых и здоровых вам волос

Убежала дописывать итоговый пост…

Продукты в посте

БЕЗАММИАЧНАЯ КРАСКА МИТРИКС [палитра цветов, отзывы]

[Безаммиачной краске Матрикс уже давно отдано первенство] на косметическом рынке нашей страны, и сегодня нет такого салона красоты, который бы не использовал в своей работе эту линию профессиональной косметики.

Тем более, что яркая палитра безаммиачных красок для волос с названием Матрикс способна максимально удовлетворить запросы женщин и девушек с любым цветотипом внешности.

Кстати, все, кто уже успел воспользоваться этой краской, получают лишь хорошее впечатление, и оставляют позитивные отзывы.

Безаммиачная краска Matrix относится к категории профсредств, которые отличаются от составов для любительского использования высоким качеством и возможностью достижения гарантированного результата.

В данном случае краска профессионального назначения Матрикс имеет неплохие отзывы и от людей парикмахерского искусства.

Так как средство Матрикс создано на безаммиачной основе, его применение позволяет свести к минимуму негативное воздействие на структуру волосков.

При этом на стойкость и красоту окрашивания это не влияет.

Красящие пигменты Matrix все же проникают в поверхностные слои каждого волоска, – объясняется этот невероятный факт присутствием в безаммиачном составе специальной косметической формулы, которая совершенствовалась технологами компании не один год.

Ее свойства позволяют в щадящем режиме доставлять пигменты вглубь волосков.

Прежде чем будет рассмотрена палитра цветов безаммиачной краски Matrix, стоит познакомиться с ее достоинствами и недостатками, которые, как не крути, есть у каждого косметического средства.

Видео:

Достоинства и отрицательные моменты использования Матрикс

Профессиональная палитра цветов Matrix имеет больше достоинств, чем недостатков, но последние все-таки есть, и некоторые из них достаточно весомые.

В данном случае отрицательные моменты заключаются в следующих фактах:

• Красящий пигмент краски не имеет в своем составе аммиака, что является причиной недолговременного результата окрашивания;
• Безаммиачная краска Матрикс, что подтверждают отзывы, не способна внести кардинальные изменения во внешность при наличии большого количества седых волосков. При этом седина всегда будет смотреться светлее на 2-3 тона от общей копны локонов, но регулярное применение безаммиачной краски все же позволит усилить нужный тон;
• Высокая стоимость безаммиачной краски, – объясняется использованием высококачественного сырья в процессе ее изготовлении.

Преимущества безаммиачной краски Матрикс определяются ее следующими свойствами:

• Щадящее воздействие крем-краски для волос Matrix, – пигмент прочно осваивается на поверхности каждого волоска в виде пленки;
• Регулярное использование краски без аммиака Матрикс позволяет обеспечить прядям яркий интенсивный цвет;
• Присутствие в профессиональном безаммиачном красящем составе витаминного комплекса и других полезных компонентов дает возможность в момент окрашивания обеспечить ухаживающую процедуру волосам. Но отдельное применение других ухаживающих средств также приветствуется;
• Широкая цветовая палитра включает в себя даже прозрачные тона, способствующие обновлению природного цвета локонов.

Продукция Matrix

Палитра оттенков Матрикс, включает в себя не один десяток роскошных цветов, благодаря чему каждая девушка сможет сделать свой выбор.

На данный момент в линейку профессиональной косметики Матрикс входят:

1. тонирующие средства, в составе которых нет аммиака – Matrix Color Sync;
2. осветляющие средства Matrix V-Light;
3. супер стойкие красящие составы Sokolor beauty.

Палитра красок без аммиака Matrix Color Sync богата модными оттенками, благодаря чему цвет можно выбрать, учитывая тон кожи и цвет глаз.

Color Sync — это бережное окрашивание волос, в составе крем-краски присутствуют ухаживающие и питательные компоненты, которые благотворно воздействуют на структуру каждого волоска и на кожный покров головы.

Видео:

Тонирующая крем-краска без аммиака Color Sync получает высокие отзывы от женщин с тонкими и ослабленными прядями.

Для них окрашивание локонов красителями с содержанием аммиака – запрещенный прием, поэтому лучшим выходом для себя они считают использование Color Sync.

Тем более что палитра цветов Color Sync содержит натуральные цвета, которые способны придать неживым тусклым локонам энергичный блеск и насыщенность.

Безаммиачные крем-краски для волос линейки Color Sync также идеально подходят тем женщинам, которые предпочитают часто менять свою внешность.

Тонирующее безаммиачное средство Color Sync быстро смывается, что позволяет сменить оттенок без риска нанести повреждение волосам.

Значительный минус тоника Color Sync заключается в невозможности покрыть седые волоски, все, чего можно добиться, — это их легкого окрашивания.

Палитра Матрикс V-Light отличный выбор для женщин, желающих сделать светлее свои локоны.

В данной палитре представлен широкий выбор тонов, начиная от платинового холодного блонда, и заканчивая теплыми оттенками золота.

Кроме того, серия красок V-Light идеально подходит не только для полного осветления прядей, но и для их зонального окрашивания или мелирования.

Несмотря на свойство краски обесцвечивать волосы на 7 тонов, их структуру защищает от повреждений входящий в состав окрашивающей формулы пантенол, также благодаря провитамину В5 обеспечивается их питание.

Палитра оттенков Sokolor beauty — это стойкая краска профессионального назначения. Ее использование позволяет обеспечить прядям насыщенный и ярко выраженный тон на длительное время.

Огромный выбор оттенков дает возможность женщинам с любым цветотипом внешности подобрать подходящий тон для своего образа.

Продукция Соколор Бьюти относится к категории красок, которые можно и нужно смешивать с бустерами для получения новых интересных цветов.

Как утверждают отзывы, путем смешивания можно получить очаровательные перламутровые, пастельные и персиковые оттенки.

Описание палитры красок для окрашивания волос Матрикс

Крем-краска для окрашивания волос Matrix представлена 50-ю шикарными оттенками, в их основе лежит специальная блестящая и смешанная палитра.

Чтобы облегчить выбор безаммиачной краски, производитель обозначил каждый цвет девяти базовых оттенков английскими буквами, где:

• пепельный указан как «А»;
• нейтральный как «N»;
• золотистый «G»;
• коричневый «B»;
• цвет мокка – «M»;
• теплый тон как «W»;
• красные тона «R»;
• цвета меди как «C»;
• цвет сирени «V».

Помимо букв английского алфавита на упаковке присутствуют цифры 1-11, каждая из которых указывает насыщенность цвета крем-краски.

Интересная цветовая гамма предлагается черноволосым, для брюнеток она составлена в виде сине-черного пепельного цвета 1А.

Также выгодными оттенками для брюнеток являются 3N с наименованием «темный шатен», 4А – пепельный и 4RW красновато-фиолетовый шатен.

Каждый из указанных цветов безаммиачной крем-краски Матрикс имеет высокостойкий красящий пигмент, что позволяет держаться краске на волосах около 4-х недель, по крайней мере, так утверждает производитель. По этому поводу отзывы клиентов содержат похожую информацию.

Что касается выбора цветовых решений для шатенок, то в продукции Матрикс присутствует шесть подходящих вариантов.

Это просто светлый шатен и шатен Мокко, теплый натуральный и темный блонд, темно-красный шатен и фиолетово-красный блондин.

Каждый указанный оттенок по максимуму близок к природному цвету, что позволяет шатенкам добиться ожидаемого результата без предварительного получения рыжины.

Палитра блонд включает такие оттенки:

1. блондин светло-перламутровый;
2. теплый светлый природный блонд;
3. супер светлый блонд Мокка;
4. супер светлый пепельный блонд;
5. тоник для блондинок – перламутровая пастель.

Используя указанные оттенки, можно в домашних условиях добиться благородного светлого цвета локонов без образования желтизны.

Правила окрашивания волос краской Матрикс

Как только подходящий цвет краски был выбран и правильно определен объем оксигента, можно приступать к окрашиванию волос.

Осуществляя процедуру в домашних условиях, ничто не мешает следовать советам профессионалов. Первый из них – перед нанесением краски голову мыть не надо.

Объясняется все просто: сальные железы кожного покрова головы, функционируя, выделяют сало, данный вид природной смазки защищает кожу и корни волос от агрессивного воздействия инородных веществ.

Далее крем-краску и активирующую эмульсию нужно соединить в соотношении 1:1, должна получиться смесь однородной консистенции.

Приготовленный состав нужно нанести вначале на корни прядей, затем распределить его по всей их длине.

Сколько нужно держать краску на волосах — будет зависеть от того, какой оттенок вы желаете получить, примерно, это 20-60 минут.

Для увеличения картинки откройте ее в новой вкладке

Более подробную и точную информацию можно получить, изучив приложенную производителем инструкцию.

После того как время вышло, красящий состав нужно смыть просто теплой проточной водой. Затем на пряди наносится ухаживающий бальзам, его рекомендуется покупать одновременно с крем-краской Матрикс.

Вы здесь:

25313 Опубликовано 27 ноября 2015

Небольшая молекула способствует образованию внеклеточного матрикса хряща и подавляет развитие остеоартрита

Высокопроизводительный скрининг небольших библиотек соединений

Библиотеки, содержащие 2320 природных и синтетических небольших соединений, были приобретены у Национального центра ресурсов по соединениям (Шанхай, Китай) и TargetMol (Бостон) , Массачусетс, США). Для первичного скрининга был разработан метод высокопроизводительного скрининга на основе изображений с использованием клеток ATDC5 (линия хондрогенных клеток мыши) в 96-луночном формате. Клетки ATDC5 обрабатывали каждой молекулой в концентрации 10 мкМ в течение 5 дней, полностью заменяя среду на второй день. Хондрогенез оценивали по окрашиванию альциановым синим, которое окрашивало хрящ-специфический матричный компонент, протеогликан (дополнительный рис. 6а). Хондрогенные стимуляторы, трансформирующий фактор роста-β3 (TGF-β3) и инсулин-трансферрин-селен (ITS), были использованы для проверки эффективности первичного скрининга ³⁶ , в котором усиленное окрашивание протеогликаном клеток ATDC5 показало положительный результат ( Дополнительный рис.6б). Чтобы проиллюстрировать защитный потенциал выбранных соединений в отношении хондрогенеза, хондроциты ОА человека обрабатывали каждым соединением в концентрации 10 мкМ в течение 6 часов. Затем исследовали уровни мРНК COL2A1 и ACAN с использованием анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR). Если уровни экспрессии мРНК были повышены, соединения рассматривались как хондрогенные индукторы (дополнительный рис. 6c).

Выделение, культивирование хондроцитов и клеток ATDC5

Хондроциты ОА человека были выделены из фрагментов хряща, которые были выделены из хряща коленного сустава пациентов с ОА, выброшенных во время операций по замене сустава, с одобрения Комитета по этике человека Третья больница Пекинского университета.Мы соблюдаем все соответствующие этические нормы при работе с участниками-людьми. И было получено информированное согласие пациентов. Первичные хондроциты крыс выделяли из фрагментов хряща, вырезанных из головок бедренной кости и мыщелков бедренной кости крыс Sprague – Dawley (SD) массой 80 г.

Фрагменты хряща измельчали ​​и расщепляли 0,2% коллагеназой типа II при 37 ° C в течение 4 часов. Клетки ресуспендировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Gibco, Калифорния, США), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS; HyClone, Логан, Юта, США).Клетки ATDC5 культивировали в среде DMEM / F12 (Gibco), содержащей 5% FBS. Все клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% CO ₂ при 37 ° C.

Культура эксплантатов хряща OA человека

Эксплантаты хряща OA

были взяты из мыщелков бедренной кости пациентов, подвергшихся тотальному артропластике коленного сустава. Вкратце, эксплантаты хряща разрезали на кусочки размером примерно 1 мм ³ . Затем эксплантаты помещали в среду DMEM, содержащую 10% FBS с добавлением BNTA (0.01–1 мкМ) или ДМСО (носитель), который меняли каждые 2 или 3 дня. После 2 или 3 недель инкубации хрящевые эксплантаты собирали для гистологических анализов, определения уровней экспрессии мРНК и анализа 1,9-диметилметиленового синего (DMMB; Sigma, США).

Индукция модели ОА и внутрисуставная инъекция BNTA

Посттравматическая модель ОА была индуцирована с помощью ACLT, выполненной на самцах крыс SD массой 80 г. Вкратце, под общей анестезией была пересечена передняя крестообразная связка правого колена.На контралатеральном колене была выполнена имитационная операция без перерезки связок. Мы случайным образом разделили крыс на шесть групп: нормальных, ложнооперированных, обработанных ACLT, получавших носитель (физиологический раствор), и получавших BNTA (0,015, 0,15, 1,5 мг / кг ^-1 ), соответственно. Для внутрисуставной инъекции BNTA растворяли в физиологическом растворе. Крысам вводили внутрисуставную инъекцию (100 мкл) BNTA или носителя два раза в неделю после операции в течение 4 или 8 недель соответственно. Этическое одобрение было получено Комитетом по уходу за животными и их использованию Научного центра здравоохранения Пекинского университета.Мы соблюдаем все соответствующие этические нормы при испытаниях и исследованиях на животных. Эксперименты на животных проводились в соответствии с соответствующими международными рекомендациями.

Экстракция

РНК и анализ ОТ-ПЦР

Тотальную РНК выделяли с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Очищенную РНК (2 мкг) подвергали обратной транскрипции с использованием набора для синтеза первой цепи кДНК RevertAid (Thermo Fisher Scientific, Бостон, Массачусетс, США). ОТ-ПЦР в реальном времени выполняли с помощью системы Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System (Фостер-Сити, Калифорния, США). Относительные уровни экспрессии генов выражали в виде кратных изменений, рассчитанных по формуле 2 ^-ΔΔCT . Значения были нормализованы к уровням экспрессии мРНК глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы ( GAPDH ) или 18S рибосомной РНК ( Rn18s ). Информация о последовательностях праймеров предоставляется по запросу.

Гистологическая оценка

Все коленные суставы крыс вырезали и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 3 дней. Затем образцы декальцинировали в течение 2 дней и дегидратировали в серии градиентных этанолов.После этого образцы заливали парафином, разрезали на срезы толщиной 5 мкм и окрашивали сафраниновым О-быстрым зеленым. Для эксплантатов хряща ОА человека процедуры гистологической оценки проводили без декальцификации. Образцы окрашивали сафранином O-fast зеленым (Solarbio, Пекин, Китай), альциановым синим (Solarbio) и подвергали иммуногистологическому окрашиванию с использованием антител, распознающих коллаген типа II (Abcam, Camrbidge, MA, США; 1: 200), типа X-коллаген (Gene Tex, Техас, США; 1: 200), COMP (Gene Tex; 1: 100) и SOD3 (Santa Cruz Biotechnology, Калифорния, США; 1: 200).

Для оценки гистопатологических изменений остеоартрозного хряща использовалась система оценки OARSI ^37,38 .

Анализ жизнеспособности клеток с использованием аламарового синего

Жизнеспособность хондроцитов после инкубации BNTA оценивали с использованием реагента для анализа жизнеспособности клеток alamarBlue ™ (Thermo Fisher Scientific). Клетки высевали в 96-луночные планшеты при 40 000 клеток мл ^{— 1} и поддерживали в культуральной среде с добавлением градуированной серии BNTA в течение 1 дня, 3 дней, 5 дней и 7 дней.Затем в каждую лунку добавляли 10 мкл реагента аламарового синего и планшеты инкубировали в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO ₂ в течение 4 часов. Измеряли флуоресценцию при длине волны возбуждения 540 нм и длине волны испускания 590 нм. Фоновый сигнал определяли с использованием только отрицательного контроля среды без клеток. % Восстановления реагента аламарового синего рассчитывали с использованием показаний флуоресценции в соответствии с инструкциями производителя.

Вестерн-блоттинг

Клетки лизировали лизисным буфером для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA), разделяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле (PAGE) и переносили на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF).Мембраны PVDF инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C, инкубировали со вторичными антителами при комнатной температуре в течение 1 ч и визуализировали с помощью системы BIO-RAD ChemiDoc XRS +. Белки анализировали с помощью антител, распознающих COL2A1 (Abcam; 1: 2000), SOX9 (Abcam; 1: 3000), SOD3 (Santa Cruz Biotechnology; 1: 100) и GAPDH (Zsjqbio, Пекин, Китай; 1: 1000).

Секвенирование РНК для транскриптома хряща

Хрящевые ткани собирали из медиальных и латеральных мыщелков бедренной кости коленных суставов после операции ACLT, обработанных BNTA (1.5 мг / кг ^-1 ) или носитель два раза в неделю в течение 4 недель соответственно. Мы выполнили анализ секвенирования РНК с помощью NovelBrain Cloud Analysis Platform. Вкратце, тотальную РНК экстрагировали из хрящевой ткани с использованием реагента Trizol (Invitrogen). Затем были созданы библиотеки кДНК для каждого объединенного образца РНК с использованием VAHTSTM Total RNA-seq (H / M / R). Анализ дифференциальной экспрессии гена и транскрипта RNA-seq исследовали с использованием TopHat и Cufflinks ³⁹ . HTseq ⁴⁰ использовали для подсчета количества генов и днРНК.Между тем, для определения экспрессии гена использовали метод FPKM. Мы применили алгоритм DESeq для расчета дифференциально экспрессируемых генов. Значительный анализ был проведен с использованием P -значения и анализа частоты ложных открытий (FDR) ⁴¹ . В то же время дифференциально экспрессируемые гены были идентифицированы с: кратным изменением> 2 или кратным изменением <0,5, FDR <0,05. Кроме того, был проведен анализ ГО, чтобы облегчить выяснение биологических последствий дифференциально экспрессируемых генов, включая биологический процесс (BP), клеточный компонент (CC) и молекулярную функцию (MF) ⁴² .Аннотации GO от NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), UniProt (http://www.uniprot.org/) и Gene Ontology (http://www.geneontology.org/). /) были загружены. Точный тест Фишера был применен для определения категорий GO, на которые значительно повлияли. Анализ путей был использован для определения путей, на которые значительно повлияли, на которые повлияли дифференциально экспрессируемые гены, согласно базе данных ⁴³ Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG). Точный тест Фишера был использован для выбора пути, на который значительно повлияли.А порог значимости был определен значением P ⁴⁴ . Сеть активности пути была построена с использованием Cytoscape ⁴⁵ для графического представления обогащенных биологических путей со значимостью ( P <0,05), включая регулируемые и подавляемые. Наконец, мы использовали метод анализа коэкспрессии, чтобы сосредоточиться на молекулярной мишени BNTA на уровне гена. Степень и значения K-core каждого значительно дифференцированно экспрессируемого гена были получены путем расчета коэффициента корреляции Пирсона между генами.Соответственно определяли важность каждого гена для модификации фенотипа (чем больше степень и значения K-core, тем выше способность коэкспрессии указанного гена). А именно, гены с более высоким рейтингом играли более важную роль во всей генной сети для модификации фенотипа, чем гены с более низким рейтингом. В сочетании со специфическими функциями этих генов была идентифицирована молекулярная мишень BNTA.

Тест с горячей пластиной

Тест с горячей пластиной применялся для анализа болевой реакции в суставах.Нормальных крыс ACLT, обработанных носителем и BNTA (0,015, 0,15 и 1,5 мг кг ^-1 ), помещали на термометр (UGO BASILE srl, VA, ITALY) при 55 ° C. Время реакции регистрировалось, когда появлялись реакции задних конечностей, такие как тряска, прыжки или облизывание. Крыс забирали, если время реакции задних конечностей превышало 30 с, во избежание ожогов. Каждую крысу измеряли трижды. И наблюдатели были слепы к эксперименту.

Испытание на грузоподъемность

Распределение веса задних лап крыс измеряли с помощью прибора для определения недееспособности (UGO BASILE srl).При тестировании внутри камеры стояли крысы, положив одну лапу на один датчик. Время продолжительности было установлено 9 с. Результаты были показаны как разница между весом, помещенным на контрлатеральную фиктивную (левую) заднюю конечность, и весом, перенесенным на ACLT (справа). Измерения проводили трижды для каждой крысы. Наблюдатели были не осведомлены о группе животных.

Тест наноиндентирования

Биомеханический анализ хрящевой ткани крысы был проведен с использованием наномеханической тестовой системы in situ (TI-900 TriboIndenter, Hysitron, Миннеаполис, Миннесота, США).Образцы хряща собирали из мыщелков бедренной кости у групп крыс ACLT ( n = 6), обработанных имитацией, наполнителем или BNTA (1,5 мг / кг ^-1 ) ( n = 6), через 4 недели. Раствор PBS использовали для поддержания гидратации хряща. Цикл вдавливания состоял из пиковой нагрузки 10 с, выдержки 2 с и разгрузки еще 10 с. Максимальная глубина вдавливания составляла 2000 нм. Твердость и модуль упругости определялись по кривой нагрузка – глубина.

Микро-КТ анализ коленных суставов

Микро-КТ анализ применялся для обнаружения развития остеофитов и ремоделирования субхондральной кости в коленных суставах крыс.Были получены интактные коленные суставы и удалены окружающие мягкие ткани, такие как кожа и мышцы, на модели ОА крыс, вызванной ACLT, после воздействия носителя и BNTA (1,5 мг кг ^-1 ) в течение 4 и 8 недель. Образцы ( n = 4 для каждой группы) сканировали с использованием микро-КТ (Siemens, Inveon MM Gantry). Трехмерная модель была реконструирована с использованием программного обеспечения Mimics Research. Гистоморфометрический анализ проводился на продольных изображениях большеберцовой субхондральной кости.Кроме того, субхондральная кость большеберцовой кости была проанализирована с использованием программного обеспечения Inveon Research Workplace (Siemens), включая трабекулярные BV / TV и Tb. ПФ.

Биохимический анализ содержания ГАГ и ДНК

Определяли влажную массу эксплантатов хряща ОА ( n = 6 на группу). После измельчения эксплантаты переваривали в течение ночи в папаиназе (125 мкг мл ^-1 ) при 60 ° C. Содержание ГАГ измеряли с помощью анализа DMMB. Лизаты (20 мкл) смешивали с 200 мкл рабочего раствора DMMB в течение 30 мин при комнатной температуре.Затем измеряли оптическую плотность при 525 нм. Хондроитинсульфат (Sigma) использовали в качестве стандарта. Содержание ДНК определяли с помощью теста Hoechst 33258 (Beyotime Biotechnology, Пекин, Китай). Вкратце, 20 мкл лизата смешивали с 200 мкл рабочего раствора Hoechst 33258 и инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. Поглощение определяли при 360 нм для возбуждения и при 460 нм для излучения. В качестве стандарта использовали ДНК тимуса теленка (Sigma). Содержание ГАГ или ДНК выражалось в микрограммах ГАГ или ДНК на миллиграмм сырого веса.

Определение активности SOD

Первичные хондроциты крысы культивировали с IL1β (10 нг / мл ^-1 ) или BNTA (0,1 мкМ) в течение 3 дней. Культуральную среду заменяли через 2 дня. Хондроциты крыс и питательные среды были получены для определения активности СОД. Вкратце, 20 мкл раствора образца или ddH ₂ O смешивали с 200 мкл рабочего раствора WST. Затем со смесями тщательно перемешивали 20 мкл буфера для разведения или 20 мкл рабочего раствора фермента. Планшеты выдерживали 20 мин при 37 ° C.Оптическую плотность при 450 нм считывали с помощью считывающего устройства для микропланшетов. Наконец, активность SOD (степень ингибирования%) была рассчитана с использованием уравнения. В соответствии с линией стандартной кривой была получена активность СОД (ЕД мл ^-1 ).

Окрашивание MitoSOX Red

Первичные хондроциты крысы обрабатывали IL1β (10 нг / мл ^-1 ) или BNTA в концентрации 0,1 мкМ в течение 2 дней. Затем наносили 1 мкМ MitoSOX Red (Thermo Fisher Scientific), разведенного в HBSS / Ca / Mg, и инкубировали с клетками в течение 10 мин при 37 ° C.Супероксид-анионы, преобладающие АФК, продуцируемые хондроцитами, были обнаружены с помощью конфокальной микроскопии. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения LAS_X (Flexera software LLC). Интенсивность флуоресценции количественно оценивали не менее чем на 6 изображениях.

Обнаружение внеклеточных супероксидных анионов

Первичные хондроциты крыс поддерживали IL1β (10 нг / мл ^-1 ) или BNTA в концентрации 0,1 мкМ в течение 3 дней, для чего культуральную среду меняли через 2 дня. Внеклеточные супероксидные анионы были обнаружены с помощью наборов для обнаружения супероксидных анионов (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Нанкин, Китай), которые моделировали реакционную систему оксигеназы астрагала и астрагала.Культуральные среды через 2 дня и 3 дня были получены и смешаны с наборами для обнаружения супероксид-анионов в течение 40 минут при 37 ° C. Затем в смесь добавляли хромогенные агенты, выдерживая 10 мин при комнатной температуре. Наконец, с помощью микропланшетного ридера измеряли оптическую плотность при 550 нм. Способность продуцировать супероксид-анионы (U l ^-1 ) рассчитывали по формуле (OD _{, образцы} — OD _{, контроль} ) / (OD _{, контроль} — OD _{, стандарт} ) × стандартная концентрация (0,15 мг / мл ^{— 1} ) × 1000 мл формулы, которую использовали для измерения содержания супероксид-анионов.DdH ₂ O считали отрицательным контролем со способностью продуцировать супероксид-анионы 0 U l ^-1 после расчета. Между тем, витамин c (Vc) считался стандартом со способностью продуцировать супероксид-анионы -150 ед. L ^-1 .

Визуализация in vivo ROS

Чтобы проверить, снизилось ли количество ROS во внеклеточных пространствах после лечения BNTA у крыс ACLT, люминол (Sigma; 2,5 мг для каждой крысы) применяли в коленных суставах после носителя или BNTA (1.5 мг кг ^-1 ) лечение через 8 недель с помощью внутривенной инъекции. Коленные суставы каждой крысы сразу визуализировали с помощью системы визуализации животных in vivo CRI (Maestro2, США).

Иммунофлуоресцентный анализ

Культивированные хондроциты промывали PBS, а затем фиксировали 10% нейтральным забуференным формалином в течение 30 минут при комнатной температуре. Triton X-100 (Beyotime Biotechnology) использовали для проникновения через клеточную мембрану в течение 5 минут, а ослиную сыворотку (Beyotime Biotechnology) применяли для блокирования участков неспецифического связывания в течение 1 часа.Культивируемые клетки инкубировали с первичными антителами против коллагена типа II (Abcam; 1: 200) и SOD3 (Santa Cruz Biotechnology; 1: 100) при 4 ° C в течение ночи. Затем клетки трижды промывали PBS, а затем инкубировали с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) -конъюгированным антителом против кроличьего IgG (Abcam; 1: 1000) или против мышиного IgG (Biolegend, США; 1: 200) в течение 1 часа. Ядра окрашивали Hoechst 33258 в течение 5 мин. Наконец, образцы промывали PBS и визуализировали с помощью конфокальной микроскопии. Программное обеспечение LAS_X (Flexera software LLC) применяли для количественной оценки интенсивности флуоресценции хондроцитов крысы по меньшей мере по 6 изображениям.

Статистический анализ

Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (s.d.). Каждая точка данных in vivo представляет отдельную крысу. Анализ выполняли с использованием статистической программы SPSS 18.0 (IBM Corp). Статистическая значимость ( P <0,05) рассчитывалась с использованием непарных двусторонних критериев Стьюдента t (две группы), одностороннего дисперсионного анализа (однородность дисперсии, три или более групп) или непараметрического теста (неравномерная дисперсия).

Иммунофлуоресцентный анализ компонентов внеклеточного матрикса подчеркивает роль эпителиальных клеток в производстве стабильного фибриллярного внеклеточного матрикса | Биология Открыть

Хроническая болезнь почек (ХБП) представляет собой серьезное бремя для общественного здравоохранения, распространенность которого превышает 10% среди взрослого населения (Mills et al., 2015). ХБП характеризуется снижением скорости клубочковой фильтрации и повышенной экскрецией альбумина с мочой, вызванной повреждением почек (Eckardt et al., 2013). Это может привести к терминальной стадии почечной недостаточности, а также может быть связано с сопутствующими заболеваниями из-за более широкого воздействия на гомеостаз организма. ХБП имеет общую патобиологию с другими фиброзными заболеваниями и представляет собой серьезную проблему для глобального здравоохранения.

Постепенное отложение и накопление избыточного внеклеточного матрикса (ВКМ) является определяющей чертой всех фиброзных заболеваний.В почке после повреждения нефрона реакция раны приводит к продукции ECM в процессе восстановления (Duffield, 2014). В случае хронического заболевания почек этот процесс восстановления не проходит, и продолжающееся накопление матрикса приводит к прогрессирующему фиброзу и рубцеванию. Накопление ECM и фиброз почек тесно коррелируют со снижением функции почек и являются постоянными признаками терминальной стадии ХБП (Genovese et al., 2014).

Фибробласты и миофибробласты почек, как полагают, являются основными эффекторными клетками, которые как синтезируют, так и откладывают фибриллярные компоненты ВКМ при почечном интерстициальном фиброзе (Strutz and Zeisberg, 2006).Эти клетки могут быть активированы цитокинами, включая трансформирующий фактор роста бета (TGF-β) (Strutz et al., 2001; Zeisberg et al., 2000; Ignotz and Massague, 1986) и фактор некроза опухоли альфа (TNFα) (Guo et al. ., 2001; Stenvinkel et al., 2005), а также стрессовые стимулы, включая гипоксию (Norman et al., 2000). Эти факторы могут привести к увеличению производства компонентов матрикса, включая фибронектин, коллаген I и коллаген III.

Роль эпителиальных клеток в отложении матрикса во время фиброза менее изучена, хотя они могут четко реагировать на фиброзные стимулы и продуцировать компоненты внеклеточного матрикса (Orphanides et al., 1997; Ng et al., 1998; Хамфрис и др., 2010). Независимо от того, претерпевают ли эти канальцевые эпителиальные клетки полное превращение в фенотип миофибробластов, они расположены так, что могут вносить значительный вклад в утолщение канальцев и дисфункцию, если они откладывают значительные количества стабильного внеклеточного матрикса (Louis and Hertig, 2015). Дополнительным механизмом, посредством которого эпителиальные клетки могут способствовать прогрессивному накоплению внеклеточного матрикса, является продукция ферментов, таких как ферменты TG2 и LOXL.Они могут поперечно связывать компоненты внеклеточного матрикса для увеличения стабильности матрикса (Gross et al., 2003; Kleman et al., 1995), а также повышения его устойчивости к деградации (Johnson et al., 1999).

Предыдущие исследования обычно изучали способность профиброгенных цитокинов увеличивать синтез ECM, а также изменения в относительной продукции белков ECM (Forino et al., 2006). Эти исследования сыграли важную роль в построении нашего понимания профиброгенных цитокинов и факторов роста.Однако они не обязательно оказывали влияние на зрелый ECM. Исследования клеточных линий грызунов снова подчеркивают эту продукцию, но не рассматривают относительную емкость эпителиальных клеток по сравнению с фибробластами в клетках человека (Creely et al., 1992). Последнее важно, поскольку при диабетической нефропатии сообщалось об экспрессии компонентов матрикса эпителиальными клетками (Razzaque et al., 1995), и мы часто наблюдаем на наших животных моделях тубулоинтерстициального фиброза расширение ЕСМ до чистой клеточной инфильтрации (рис.S1). Поэтому мы разработали иммунофлуоресцентный анализ с использованием эпителиальных клеток человека, в котором мы удаляем клеточные компоненты, чтобы позволить нам сосредоточиться непосредственно на оставшихся депонированных ECM. Используя этот анализ, мы попытались проверить гипотезу о том, что первичные эпителиальные клетки проксимальных канальцев почек человека могут откладывать ECM сопоставимого качества и количества с первичными почечными фибробластами, и что это частично вызвано перекрестными помехами между фибробластами и эпителиальными клетками.

Хотя фибробласты обычно считаются первичными клетками, вносящими вклад в созревание внеклеточного матрикса, эпителиальные клетки канальцев экспрессируют несколько компонентов внеклеточного матрикса, включая фибронектин и коллаген IV (Bürger et al., 1998; Razzaque et al., 1995). Важно отметить, что эти клетки также обладают способностью экспрессировать фибриллярные коллагены I и III, которые связаны с заболеванием почек. Поэтому мы хотели изучить накопленный матрикс, который стабильно откладывается каждым типом клеток.

Первоначально мы провели сравнение общего внеклеточного матрикса, продуцируемого эпителиальными клетками и фибробластами, с использованием установленного анализа включения радиоактивных аминокислот ¹⁴ C для измерения общего депонированного внеклеточного матрикса.Как и ожидалось, фибробласты продуцировали значительные количества матрикса в базовых условиях, и это было примерно удвоено при обработке TGF-β1 (рис. 1D). Хотя ECM, депонируемый эпителиальными клетками в базальных условиях, был примерно в четыре раза ниже, чем HRF, он значительно увеличивался в ответ на стимуляцию (от трех до пяти раз), достигая базального уровня в фибробластах.

Чтобы понять более подробно компоненты и организацию этого зрелого депонированного внеклеточного матрикса, мы использовали иммунофлуоресцентный подход на основе визуализации для визуализации ключевых компонентов зрелого внеклеточного матрикса.Это позволило нам исследовать фибриллярные коллагены, связанные с фиброзным матриксом. Для этого мы сначала удалили культивируемые клетки, зафиксировали депонированный внеклеточный матрикс, пометили компоненты матрикса с помощью антител, затем визуализировали и количественно оценили эту матрицу с помощью визуализации с высоким содержанием (рис. 2A, см. Материалы и методы). В базовых условиях мы наблюдали сопоставимое отложение фибронектина фибробластами и эпителиальными клетками (рис. 2B-D). Базальное отложение коллагена I и III, полученное с фибробластами, было примерно в два-три раза выше, чем уровни, полученные с использованием эпителиальных клеток.Напротив, эпителиальные клетки легко откладывают коллаген IV, а фибробласты — нет. После стимуляции TGF-β1 эпителиальные клетки показали увеличение уровней всех трех компонентов ECM, которые накапливались в структуре фибриллярного матрикса, и на уровнях, существенно не отличающихся от фибробластов (фиг. 2B-D). Качественно матрикс фибробластов имел более толстые фибриллы коллагена с разреженными участками. В эпителиальных клетках матрица была более ровной и состояла из более тонких фибрилл.Следовательно, эпителиальные клетки были способны депонировать эквивалентный уровень компонентов матрикса, ассоциированного с фиброзом, в фибробласты.

Рис. 2.

Стимулированные эпителиальные клетки проксимальных канальцев продуцируют зрелый отложенный внеклеточный матрикс, сопоставимый с матрицей, создаваемой фибробластами. (A) Диаграмма, показывающая метод иммунофлуоресцентного анализа депонированных ЕСМ. (B) Эпителиальные клетки, культивированные в течение 6 дней со стимуляцией или без стимуляции 10 нг / мл TGFβ1.Затем клетки удаляли, внеклеточный матрикс фиксировали и клетки окрашивали с использованием антител против коллагена I, III, IV и фибронектина. Каждая панель показывает изображение одного репрезентативного поля из четырех независимых экспериментов. Масштабные линейки: 100 мкм. (C) Фибробласты, культивированные со стимуляцией или без нее в течение 6 дней и окрашенные, как в B. Шкала шкалы: 100 мкм. (D) Графики показывают результаты количественной оценки фибриллярного внеклеточного матрикса по изображениям, как на B и C. Результаты представляют собой среднее значение из четырех независимых экспериментов с 6 повторами на эксперимент, t -тест, выполненный на основе значений из независимых экспериментов, * * P <0.01, *** P <0,001; планки погрешностей указывают среднее значение ± s.e.m.

Рис. 2.

Стимулированные эпителиальные клетки проксимальных канальцев продуцируют зрелый отложенный внеклеточный матрикс, сопоставимый с матрицей, создаваемой фибробластами. (A) Диаграмма, показывающая метод иммунофлуоресцентного анализа депонированных ЕСМ. (B) Эпителиальные клетки, культивированные в течение 6 дней со стимуляцией или без стимуляции 10 нг / мл TGFβ1. Затем клетки удаляли, внеклеточный матрикс фиксировали и клетки окрашивали с использованием антител против коллагена I, III, IV и фибронектина.Каждая панель показывает изображение одного репрезентативного поля из четырех независимых экспериментов. Масштабные линейки: 100 мкм. (C) Фибробласты, культивированные со стимуляцией или без нее в течение 6 дней и окрашенные, как в B. Шкала шкалы: 100 мкм. (D) Графики показывают результаты количественной оценки фибриллярного внеклеточного матрикса по изображениям, как на B и C. Результаты представляют собой среднее значение из четырех независимых экспериментов с 6 повторами на эксперимент, t -тест, выполненный на основе значений из независимых экспериментов, * * P <0.01, *** P <0,001; планки погрешностей указывают среднее значение ± s.e.m.

Чтобы понять, является ли пролиферация ответственной за это увеличенное отложение внеклеточного матрикса, мы первоначально провели подсчет эпителиальных клеток после стимуляции TGF-β1. Хотя мы не наблюдали значительного увеличения количества эпителиальных клеток (рис. 3A), мы наблюдали повышенную экспрессию мРНК для компонентов матрикса фибронектина, коллагена I и коллагена IV (рис.3Б).

Рис. 3.

Первичные эпителиальные клетки проксимальных канальцев почек человека, активированные TGFβ1, обладают повышенной продукцией внеклеточного матрикса. (A) Нет изменений в количестве эпителиальных клеток при стимуляции 10 нг / мл TGFβ1. Через 6 дней клетки фиксировали, ядра окрашивали DAPI, а изображения анализировали для определения количества клеток на поле. Показан один репрезентативный эксперимент из трех. Данные показывают среднее значение ± с.d. для трех повторяющихся лунок. (B) мРНК для транскриптов компонентов внеклеточного матрикса определяли с помощью qRT-PCR через 48 часов в культуре с TGFβ1. Данные показывают среднее значение ± стандартное отклонение. для четырех независимых экспериментов. Однофакторный дисперсионный анализ по сравнению с нестимулированным контролем, **** P <0,001; * P <0,05.

Рис. 3.

Первичные эпителиальные клетки проксимальных канальцев почек человека, активированные TGFβ1, обладают повышенной продукцией внеклеточного матрикса. (A) Нет изменений в количестве эпителиальных клеток при стимуляции 10 нг / мл TGFβ1.Через 6 дней клетки фиксировали, ядра окрашивали DAPI, а изображения анализировали для определения количества клеток на поле. Показан один репрезентативный эксперимент из трех. Данные показывают среднее значение ± стандартное отклонение. для трех повторяющихся лунок. (B) мРНК для транскриптов компонентов внеклеточного матрикса определяли с помощью qRT-PCR через 48 часов в культуре с TGFβ1. Данные показывают среднее значение ± стандартное отклонение. для четырех независимых экспериментов. Однофакторный дисперсионный анализ по сравнению с нестимулированным контролем, **** P <0,001; * P <0,05.

Взятые вместе, эти результаты показывают, что эпителиальные клетки способны продуцировать стабильный фибриллярный матрикс с компонентами, ассоциированными с фиброзом, в количествах, сравнимых с фибробластами, в ответ на стимуляцию цитокинами.

In vivo положение эпителиальных клеток оставляет их подверженными внеклеточным стрессам, которые могут вызвать начало фиброза. Хроническое воздействие гипоксии (Fine and Norman, 2008) или химических стрессов (Debelle et al., 2002) in vivo приводит к отложению внеклеточного матрикса, фиброзу и хроническому заболеванию почек.

Поэтому мы исследовали способность двух стрессовых стимулов вызывать отложение матрикса в изолированных эпителиальных клетках: H ₂ O ₂ вызывать окислительный стресс (Okamura and Pennathur, 2015) и аристолоховая кислота имитировать повреждение почек (Luciano and Perazella , 2015).В нашей изолированной системе эти триггеры не вызывали значительного увеличения стабильного отложения фибронектина или коллагена в концентрациях, которые существенно не влияли на количество клеток (рис. 4A, B). В соответствии с этим мы не наблюдали увеличения мРНК для фибронектина, коллагена I, коллагена III или коллагена IV (рис. 4C). Это отсутствие индукции может отражать потребность в дополнительных типах клеток, таких как иммунные клетки, для модуляции ответа, или потребность в более хронических стимулах для индукции отложения внеклеточного матрикса.

Рис. 4.

Перекись водорода и аристолоховая кислота не влияют на отложение внеклеточного матрикса в RPTEC. (A) Влияние H ₂ O ₂ на отложение внеклеточного матрикса при анализе с использованием иммунофлуоресцентного анализа ECM. Эпителиальные клетки инкубировали в течение 6 дней с указанными концентрациями H ₂ O ₂ (белые столбики). (B) Как A, за исключением аристолоховой кислоты (AA), использованной в качестве стимула.Показан характерный пример из двух независимых экспериментов. (C) мРНК для транскриптов компонентов внеклеточного матрикса, определенная с помощью qRT-PCR после 48 часов культивирования с AA или H ₂ O ₂ . Данные показывают среднее значение ± стандартное отклонение. для четырех независимых экспериментов.

Рис. 4.

Пероксид водорода и аристолоховая кислота не влияют на отложение внеклеточного матрикса в RPTEC. (A) Влияние H ₂ O ₂ на отложение внеклеточного матрикса при анализе с использованием иммунофлуоресцентного анализа ECM.Эпителиальные клетки инкубировали в течение 6 дней с указанными концентрациями H ₂ O ₂ (белые столбики). (B) Как A, за исключением аристолоховой кислоты (AA), использованной в качестве стимула. Показан характерный пример из двух независимых экспериментов. (C) мРНК для транскриптов компонентов внеклеточного матрикса, определенная с помощью qRT-PCR после 48 часов культивирования с AA или H ₂ O ₂ . Данные показывают среднее значение ± стандартное отклонение. для четырех независимых экспериментов.

Гипоксия — еще один стимул, который может вызывать фиброз in vivo через HIF-1α (Higgins et al., 2007), а также увеличивает экспрессию мРНК для компонентов внеклеточного матрикса (Norman et al., 2000; Orphanides et al., 1997). Поэтому мы проверили влияние гипоксии на отложение ВКМ эпителиальных клеток. Хотя мы не наблюдали последовательного увеличения стабильного отложения фибриллярного коллагена I и III или фибронектина в условиях гипоксии, мы наблюдали большое увеличение отложения коллагена IV, которое могло быть дополнительно увеличено добавлением TGF-β1 (рис. 5). Качественно эта матрица оказалась другой структуры.Это согласуется с предыдущими сообщениями, описывающими чувствительность этих клеток к гипоксии (Norman et al., 2000; Orphanides et al., 1997) и демонстрирующими, что откладывается дополнительный зрелый ECM, который может вносить вклад в дальнейшую дисфункцию канальцев. Эти результаты показывают, что в изолированной культуре накопленный ответ эпителиальных клеток ЕСМ, хотя и относительно нечувствителен к химическим агентам, может значительно модулироваться гипоксией.

Рис.5.

Ответ RPTEC на гипоксию. (A) Эпителиальные клетки, выращенные в течение шести дней в нормоксических или гипоксических (2,5% O ₂ ) условиях со стимуляцией 10 нг / мл TGF-β1 или без нее, оценивали на продукцию внеклеточного матрикса с использованием иммунофлуоресцентного анализа. На графиках показаны данные трех независимых экспериментов, полосы ошибок показывают среднее значение ± s.e.m. *** P <0,001, * P <0,1, парный тест t , проведенный на основе средств независимых экспериментов.(B) Типичные изображения депонированных компонентов внеклеточного матрикса из эпителиальных клеток в A. Масштабные полосы: 100 мкм.

Рис. 5.

Ответ RPTEC на гипоксию. (A) Эпителиальные клетки, выращенные в течение шести дней в нормоксических или гипоксических (2,5% O ₂ ) условиях со стимуляцией 10 нг / мл TGF-β1 или без нее, оценивали на продукцию внеклеточного матрикса с использованием иммунофлуоресцентного анализа. На графиках показаны данные трех независимых экспериментов, полосы ошибок показывают среднее значение ± s.Эм. *** P <0,001, * P <0,1, парный тест t , проведенный на основе средств независимых экспериментов. (B) Типичные изображения депонированных компонентов внеклеточного матрикса из эпителиальных клеток в A. Масштабные полосы: 100 мкм.

В результате относительной невосприимчивости эпителиальных клеток к острым стрессовым стимулам мы проверили, могут ли другие типы клеток влиять на продукцию внеклеточного матрикса эпителиальными клетками.Хотя фибробласты играют хорошо установленную роль продуцентов внеклеточного матрикса, они экспрессируют несколько факторов, которые могут изменять поведение эпителиальных клеток канальцев (Johnson et al., 1997). Мы совместно культивировали равное количество фибробластов и эпителиальных клеток и измеряли ЕСМ с помощью иммунофлуоресценции. В отсутствие экзогенного стимула совместное культивирование фибробластов и эпителиальных клеток приводило к более высоким уровням отложения матрикса, чем можно было бы объяснить одним и тем же общим количеством клеток любого типа отдельно и до такого же уровня, как при стимуляции TGF- β1 (рис.6А, Б). Это увеличение было наиболее заметным для коллагена I и III, где увеличение было более чем в три раза больше, чем можно было бы объяснить либо культурой, содержащей только фибробласты, либо ожидаемым уровнем для культуры 50:50 двух типов клеток. Это указывает на то, что эти компоненты и их сборка фибриллярных структур были существенно затронуты взаимодействиями между клетками. TGF-β является основным фиброзным стимулом, который может продуцироваться и активироваться обоими типами клеток, которые, как мы ранее показали, управляют стабильным отложением фибриллярного внеклеточного матрикса.Добавление антитела против TGF-β к нестимулированной совместной культуре эпителиальных клеток с фибробластами привело к более чем четырехкратному снижению отложения матрикса фибронектина и коллагена I / III с небольшим изменением жизнеспособности клеток (рис. 7A, B). Эти результаты подчеркивают роль TGF-β как основной движущей силы отложения ECM в этой системе совместного культивирования.

Рис. 6.

Совместное культивирование фибробластов и эпителиальных клеток модулирует продукцию внеклеточного матрикса. (A) Типичные изображения матрикса, накопленного эпителиальными клетками и фибробластами в монокультуре или совместной культуре при соотношении клеток 1: 1 (с равным общим количеством клеток на лунку) при культивировании в течение шести дней без стимуляции. Клетки были очищены, матрикс фиксирован и иммуноокрашен на компоненты матрикса: фибронектин (зеленый), коллаген I и III (красный), коллаген IV (синий). Масштабные линейки: 100 мкм. (B) Количественная оценка иммунофлуоресценции компонентов внеклеточного матрикса для клеток, как в A, со стимуляцией 10 нг / мл TGFβ1 и без нее.Графики показывают среднее значение для четырех повторяющихся лунок ± среднеквадратичное отклонение, показан один репрезентативный эксперимент из трех.

Рис. 6.

Совместное культивирование фибробластов и эпителиальных клеток модулирует продукцию внеклеточного матрикса. (A) Типичные изображения матрикса, накопленного эпителиальными клетками и фибробластами в монокультуре или совместной культуре при соотношении клеток 1: 1 (с равным общим количеством клеток на лунку) при культивировании в течение шести дней без стимуляции. Клетки были очищены, матрикс фиксирован и иммуноокрашен на компоненты матрикса: фибронектин (зеленый), коллаген I и III (красный), коллаген IV (синий).Масштабные линейки: 100 мкм. (B) Количественная оценка иммунофлуоресценции компонентов внеклеточного матрикса для клеток, как в A, со стимуляцией 10 нг / мл TGFβ1 и без нее. Графики показывают среднее значение для четырех повторяющихся лунок ± среднеквадратичное отклонение, показан один репрезентативный эксперимент из трех.

Рис. 7.

Блокада TGFβ снижает отложение матрикса совместно культивируемых эпителиальных клеток и фибробластов. (A) Эпителиальные клетки и фибробласты совместно культивировали без дополнительной стимуляции в течение шести дней в присутствии указанных концентраций либо контроля, либо антитела против TGFβ.Внеклеточный матрикс окрашивали и анализировали методом иммунофлуоресценции, как описано ранее. На графиках показано среднее значение трех независимых экспериментов ± s.e.m. (B) Панели показывают репрезентативные изображения клеток из A. Масштабные полосы: 100 мкм.

Рис. 7.

Блокада TGFβ снижает отложение матрикса совместно культивируемых эпителиальных клеток и фибробластов. (A) Эпителиальные клетки и фибробласты совместно культивировали без дополнительной стимуляции в течение шести дней в присутствии указанных концентраций либо контроля, либо антитела против TGFβ.Внеклеточный матрикс окрашивали и анализировали методом иммунофлуоресценции, как описано ранее. На графиках показано среднее значение трех независимых экспериментов ± s.e.m. (B) Панели показывают репрезентативные изображения клеток из A. Масштабные полосы: 100 мкм.

Таким образом, мы разработали основанный на иммунофлуоресценции метод для количественной оценки компонентов зрелого накопленного внеклеточного матрикса с использованием человеческих клеток. Важно отметить, что мы оценили только зрелый собранный ЕСМ, удалив клеточный компонент и визуализируя только оставшийся ЕСМ.Это ключевой момент, поскольку он представляет не только увеличение транскрипции и трансляции (как было продемонстрировано в предыдущих исследованиях), но также посттрансляционную модификацию, сборку ЕСМ, а также гомеостатический баланс, достигаемый с изменением систем клиренса ЕСМ, таких как матрица. металлопротеиназы (ММП) и плазмин. В ответ на TGF-β1 RPTEC продемонстрировали четкое отложение компонентов ECM, включая фибриллярные коллагены I и III. Кроме того, мы исследовали в прямом сравнении способность эпителиальных и фибробластных ответов на наиболее узнаваемый профибротический цитокин TGF-β1 и показали, что обе клетки обладают почти равной способностью генерировать компоненты зрелого депонированного ECM.

Предыдущие исследования продемонстрировали роль гипоксии в увеличении продукции ECM из RPTEC, и мы подтверждаем здесь, что он откладывается в виде зрелого фибриллярного внеклеточного матрикса (Norman et al., 2000; Orphanides et al., 1997). В отличие от стимуляции цитокинов и гипоксии, мы наблюдали относительную нечувствительность монокультуры эпителиальных клеток к стрессовым стимулам, и это может представлять собой отсутствующий компонент, такой как иммунные клетки, в этой системе анализа in vitro (Lupher and Gallatin, 2006 ).В этом исследовании мы не нормализовали количество клеток, так как в конечном итоге количество оставшегося матрикса было наиболее важным для фиброзного процесса, который мы пытались смоделировать. Мы наблюдали умеренное снижение (10%) количества эпителиальных клеток и умеренное увеличение на 20% сигнала PrestoBlue, маркера метаболической активности, поэтому нормализация существенно не повлияла на результаты (данные не показаны).

Наконец, мы наблюдали, что совместное культивирование эпителиальных клеток и фибробластов приводит в значительной степени к TGF-β-зависимому увеличению продукции базального матрикса.Возможно, что в результате повреждения канальцев взаимодействия между фибробластами и эпителиальными клетками могут быть усилены, как и при других фиброзных заболеваниях (Sakai and Tager, 2013; Gabison et al., 2009; Moll et al., 2013). Это увеличение может быть результатом таких ферментов, как LOXL2 или TG2, которые могут сшивать и стабилизировать матрикс (Fisher et al., 2009). В качестве альтернативы сообщалось, что почечные фибробласты экспрессируют TGF-β (Grupp et al., 2001), который может быть активирован интегринами, экспрессируемыми на эпителиальных клетках (Rabb et al., 1996; Hinz, 2015). Ранее сообщалось о перекрестном взаимодействии между этими типами клеток, поскольку сообщалось, что эпителиальные клетки канальцев крыс влияют на экспрессию фибробластов α-гладкомышечного актина (Lewis and Norman, 1998). Это также похоже на взаимодействие между подоцитами и эндотелиальными клетками, которое изменяет ECM (Byron et al., 2014). Тем не менее, многие вопросы остаются без ответа, и механизм этого перекрестного взаимодействия фибробластов и эпителия активно исследуется. В то время как вклад внеклеточного матрикса, полученного из эпителиальных клеток, в фиброз in vivo менее очевиден, при диабетической нефропатии эпителиальные клетки демонстрируют повышенную регуляцию компонентов внеклеточного матрикса коллагена III и IV (Razzaque et al., 1995), а утолщение базальной мембраны является признаком хронического заболевания почек, которое часто предшествует увеличению количества фибробластов в экспериментальных моделях (Рис. S1) (Gilbert and Cooper, 1999). Таким образом, эпителиальная клетка или фибробласт-эпителиальная клетка могут представлять собой важные терапевтические мишени при фиброзном заболевании.

Таким образом, в соответствии с нашей гипотезой, мы продемонстрировали, что после стимуляции цитокинами первичные эпителиальные клетки человека могут отвечать, производя стабильный фибриллярный внеклеточный матрикс, сопоставимый с матриксом, генерируемым активированными фибробластами.Эта способность депонировать ECM как таковая, особенно фибриллярные коллагены, а также усиленное депонирование в условиях гипоксии и контактное совместное культивирование с фибробластами может внести значительный вклад в развитие фиброзного заболевания.

Первичные эпителиальные клетки проксимальных канальцев почек человека были приобретены у Innoprot (Дерио, Испания) и в Американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, США) и содержались в базальной среде почечных эпителиальных клеток (ATCC) с добавлением компонентов набора для роста эпителиальных клеток почек ( АТСС).Первичные почечные фибробласты человека были приобретены у Innoprot и содержались в среде DMEM F12 (Invitrogen), содержащей 10% FCS и дополненной 2 мМ L-глутамином. Для экспериментов использовали среду эпителиальных клеток для обоих типов клеток. Клетки выращивали при 100% влажности и 5% CO ₂ при 37 ° C и использовали до пассажа 6. Для экспериментов с гипоксией клетки выращивали в 2,5% O ₂ и 5% CO ₂ с использованием Panasonic MCO. -19 М инкубатор. Для стимуляции цитокинами клетки инкубировали с 10 нг / мл TGFβ1 (RnD Systems, Миннеаполис, США), добавленным в начале культивирования.Аристолоховая кислота и H ₂ O ₂ были от Sigma и использовались в указанных концентрациях. Для блокады TGF-β клетки инкубировали с анти-TGF-β MAB1835 или подходящим изотипическим контролем (RnD Systems) в течение периода культивирования.

Для иммунофлуоресценции клетки помещали в 384-луночные или 96-луночные планшеты для визуализации с темными стенками (BD Biosciences, Великобритания) в среде эпителиальных клеток.Для экспериментов по совместному культивированию клетки помещали в среду для эпителиальных клеток с равным общим числом клеток. Клетки высевали при 70% слиянии и достигали полного слияния через три дня после начала эксперимента.

Для окрашивания клеток клетки выращивали в течение 6 дней перед фиксацией с использованием 4% PFA (Life Technologies, Карлсбад, США). Клетки были проницаемы с использованием 0,1% сапонина (Life Technologies) в PBS перед окрашиванием анти-FSP1 (Cell Signaling Technologies, # 13018), α-актином гладких мышц (Sigma) и цитокератином 18, конъюгированным с Alexa Fluor488 (EBioscience, Сан-Диего, США. , клон LDK18).Затем клетки промывали и инкубировали с антивидовыми вторичными антителами Alexa Fluor555 или 647 и DAPI для ядерного окрашивания (Life Technologies). Для окрашивания внеклеточного матрикса клетки сначала удаляли с использованием 0,25 М гидроксида аммония в 50 мМ Трис, pH 7,4, как описано ранее (Fisher et al., 2009). Оставшийся матрикс затем фиксировали с использованием 100% метанола при -20 ° C с последующим окрашиванием конъюгированным с Alexa Fluor488 антифибронектином (EBioscience, клон FN-3, разведение 1 в 250), антиколлагеном I и III (Merck Millipore, Billerica , USA, AB745 и AB747, разведение 1: 100) и антиколлаген IV, конъюгированный с eFluor660 (EBioscience, клон 1042, разведение 1: 100).Анти-коллаген I и III детектировали с использованием вторичных антител против кролика, конъюгированных с Alexa Fluor555 (1: 500, Life Technologies).

Сборка и разработка матрицы биопленок Pseudomonas aeruginosa

Образец цитирования: Ma L, Conover M, Lu H, Parsek MR, Bayles K, Wozniak DJ (2009) Сборка и разработка матрицы биопленок Pseudomonas aeruginosa . PLoS Pathog 5 (3):
e1000354.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.ppat.1000354

Редактор: Frederick M. Ausubel, Массачусетская больница общего профиля, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 9 декабря 2008 г .; Одобрена: 27 февраля 2009 г .; Опубликовано: 27 марта 2009 г.

Авторские права: © 2009 Ma et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Грант Фонда кистозного фиброза (CFF) WOZNIA06P0 (http://www.cff.org/) и гранты Службы общественного здравоохранения AI061396 и HL058334 (DJW; http://www.nhlbi.nih.gov/ и http://www3.niaid.nih.gov/) поддержали эту работу. Постдокторская стипендия CFF MA06F0 поддерживает LM (http://www.cff.org/). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Структурированные, связанные с поверхностью сообщества бактерий (биопленки) преобладают в экологических и клинических условиях [1]. Биопленочные бактерии менее восприимчивы к антимикробным агентам и защищены от иммунного ответа хозяина, что приводит к хроническим инфекциям, которые, как известно, трудно искоренить [2], [3]. Считается, что внеклеточное полимерное вещество (EPS) поддерживает архитектуру биопленки и функционирует как матрица или клей, удерживая клетки биопленки вместе и защищая их от сил сдвига в жидких средах [4].Образуя заключенный в матрикс многоклеточный агрегат, клетки также могут избегать поглощения фагоцитарными клетками в организме-хозяине-млекопитающем. Удивительно, но мало известно о том, как формируется внеклеточный матрикс на различных стадиях развития биопленки и какие компоненты матрикса удерживают клетки биопленки вместе на поверхностях. Полное понимание ультраструктуры матрикса биопленки имеет решающее значение для рационального дизайна ингибиторов, которые могли бы предотвратить многочисленные клинические и экологические осложнения, связанные с биопленками.

Pseudomonas aeruginosa — это условно-патогенный микроорганизм человека, который может вызывать опасные для жизни инфекции у пациентов с муковисцидозом (CF) и людей с ослабленной иммунной системой [5] — [7]. Эта экологическая бактерия может образовывать биопленки на различных поверхностях, таких как слизистые пробки легких при МВ, загрязненные катетеры и контактные линзы [8], [9]. P. aeruginosa стал образцом для лабораторных исследований биопленок. Биопленки P.aeruginosa развиваются в пятиэтапном межклеточном цикле, который инициируется прикреплением свободных (планктонных) клеток к поверхности с последующим образованием микроколоний и, наконец, рассеянием семян, в результате чего плавающие клетки из микроколоний выходят, чтобы занять новую поверхность [4 ].

Матрикс или EPS биопленок P. aeruginosa представляет собой плохо определенную смесь полисахаридов, нуклеиновых кислот и белков [10] — [13]. Экзополисахариды, основной компонент внеклеточного матрикса тканей животных и растений, также являются важным компонентом микробных биопленок [14].По крайней мере, три экзополисахарида, Psl, Pel и альгинат вносят вклад в образование биопленок у P. aeruginosa [11], [15]. Экзополисахарид Psl, кодируемый из локуса синтеза полисахарида (PA2231-2245), необходим для того, чтобы бактериальные клетки прилипали к субстрату и сохраняли структуру биопленки [12], [16] — [18]. Наша предыдущая работа показала, что Psl состоит из маннозы, галактозы, рамнозы, глюкозы и следовых количеств ксилозы. Однако точная биохимическая структура Psl не была определена.Хотя предполагалось, что Psl способствует взаимодействиям как клетка-клетка, так и клеточной поверхности, мало что известно о том, как Psl закрепляется на поверхности бактериальной клетки и как он может способствовать этим взаимодействиям. На сегодняшний день экзополисахаридный матрикс не был непосредственно визуализирован на различных стадиях развития во время формирования биопленки P. aeruginosa .

Помимо экзополисахаридов, внеклеточная ДНК (еДНК) является важным компонентом матрикса биопленки P. aeruginosa [10], [12], [13].EDNA, по-видимому, происходит из случайной хромосомной ДНК, которая функционирует как компонент межклеточного соединения в биопленке [10]. Клетки также подвергаются автолизу в микроколониях биопленок [19], но неясно, вносит ли автолиз вклад в развитие эДНК и биопленок. Также было показано, что эДНК в матрице биопленки способствует градиентам катионов, высвобождению геномной ДНК и индуцибельной устойчивости к антибиотикам [20].

В настоящем отчете мы использовали Psl-специфическое окрашивание лектина с последующей конфокальной сканирующей лазерной микроскопией (CLSM) для визуализации Psl на поверхности клеток и в матрице EPS.Результаты показывают спиральную картину окрашивания Psl на поверхности бактериальных клеток на стадии зарождения биопленки. Закрепление Psl на клеточной поверхности важно для образования матрикса Psl и инициирования биопленки. Матрица Psl визуализировалась в реальном времени во время цикла развития биопленки. Это показывает, как матрица формирует и покрывает бактериальные клетки в биопленке и на поверхности, и как матрица меняет структуру, чтобы поддерживать архитектуру биопленки во время развития.Используя методологии двойного окрашивания, мы показываем, что матрицы eDNA и Psl не перекрываются, но, по-видимому, координируют деятельность для поддержания структуры биопленки. Мы предполагаем, что, как и высшие организмы, P. aeruginosa может использовать запрограммированную гибель клеток и автолиз для разрушения матрикса Psl в центре микроколонии, чтобы освободить «семена биопленки» для будущего распространения.

Результаты / Обсуждение

Psl закреплен на поверхности ячейки по спирали

Для визуализации Psl на поверхности бактериальной клетки и обнаружения экзополисахарида Psl на стадии прикрепления биопленки мы использовали флуоресцентно меченые лектины MOA (из Marasmium oreades agglutinin) или HHA (из Hippeastrum hybrid ) для окрашивания индивидуума P. .aeruginosa клеток. Лектины MOA и HHA обнаруживают структуру галактозы и маннозы в Psl, соответственно, и мы ранее продемонстрировали, что они специфически окрашивают Psl [21]. Клеткам позволяли прикрепиться к стеклянной поверхности, сохраняя Psl в его естественном состоянии на бактериальной поверхности. Когда прикрепленные к поверхности клетки P. aeruginosa WFPA801 (штамм, сверхпродуцирующий Psl) окрашивали FITC-MOA, мы обнаружили, что Psl был связан с поверхностью бактериальных клеток. Что еще более интересно, большинство клеток имело спиралевидный узор флуоресценции (зеленый на рисунке 1А).Такие паттерны наблюдались только с Ps1, окрашенным MOA, но не с FM4-64 (красный на рисунке 1A), который окрашивал клеточную мембрану. Эти спиральные паттерны наблюдались при делящихся (рис. 1A), а также неделящихся клетках (рис. 1B и 1C). Спиральный рисунок Psl на поверхности клетки также был замечен при окрашивании HHA (зеленый, рисунок 1B). Более того, двойное окрашивание клеток WFPA801 FITC-HHA и TRITC-MOA показало сходный спиральный узор (сравните зеленые с белыми изображениями на рисунке 1C).

Рисунок 1.Результаты окрашивания лектином бактерий, прикрепленных к поверхности; Psl закреплен на поверхности клетки бактерий в виде спирали.

(A) MOA-FITC (зеленый) и мембранное окрашивание FM4-64 (красный), двойное окрашивание клеток WFPA801. Зеленое изображение показывает окрашивание спиральных структур вокруг поверхности клетки, как показано на вставке. Белая стрелка указывает место разделения. (B) Оптический срез окрашенных HHA-FITC клеток WFPA801 без (1) или с (1 ‘) деконволюцией. (C) HHA-FITC и MOA-TRITC (белый) двойное окрашивание клеток WFPA801.(D) Окрашенные HHA-FITC клетки PAO1. На всех панелях зеленый и красный сигналы представляют собой объединенные изображения FITC-лектинов и окрашенных FM4-64 клеток. Серый сигнал представляет изображения DIC, а зеленый с серым — объединенные изображения FITC-лектинов с изображениями DIC. Масштабные линейки, 1 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000354.g001

На необработанных изображениях спиральные структуры выглядели как серия плохо разрешенных диагональных полос (изображение 1, рисунок 1B). Чтобы получить изображения после деконволюции [22] — [24], мы оптически разделили отдельные ячейки на серию изображений, фокальные плоскости которых простираются по ширине ячейки.Большая часть расфокусированной информации была удалена из каждого раздела с помощью итеративной деконволюции для получения более четких изображений. После деконволюции сигнал появился в виде серии параллельных изогнутых диагональных полос, которые представляли одну грань спирального массива, намотанного вокруг ячейки (изображение 1 ‘, Рисунок 1B).

Спиральный паттерн окрашивания Psl на рис. 1A – 1D наблюдался в клетках WFPA801, выращенных в условиях, которые экспрессируют повышенные уровни Psl [18]. Чтобы убедиться, что спиральный узор не является артефактом сверхпродукции Psl, мы окрашивали прикрепленные к поверхности клетки PAO1 дикого типа.Хотя его труднее различить, Psl также имел спиралевидный узор на поверхности клеток PAO1 (зеленый на рис. 1D).

Межклеточные взаимодействия являются основным элементом структуры биопленки. Предыдущие данные предполагают, что Psl способствует межклеточным взаимодействиям [12], [16] — [18]. Спиральное распределение Psl на поверхности P. aeruginosa может легко способствовать взаимодействию с Psl на соседних бактериях. Это создаст матрицу и может усилить межклеточные взаимодействия, поскольку контакты между соседними спиралями часто стабилизируют макромолекулы.Более того, спиральное распределение может быть свойством, сохраняющимся среди палочковидных бактерий, что позволяет им эффективно организовывать свою клеточную периферию. Белки бактериального цитоскелета, такие как родственный актину белок MreB, тубулиноподобный белок FtsZ и белки размещения сайтов деления MinCDE, образуют спиральные филаменты, намотанные на палочковидную бактериальную клетку [22] — [24]. Белки внешней мембраны и липополисахариды также имеют спиральный узор, закрепленный на поверхности клетки [25], и также сообщалось о спиральном механизме сборки пептидогликанов [26].Сам полисахарид Psl может иметь спиралевидную структуру, поскольку переплетенные спирали могут также образовываться между полимерами полисахаридов [27].

Наиболее логичным объяснением спиральной структуры Psl является то, что механизм биосинтеза Psl сам по себе организован по такой схеме. Это сделало бы возможным сопряженный синтез, экспорт и сборку Psl, ассоциированного с клеточной поверхностью. Альтернативно, компоненты внешней мембраны, такие как белки или липиды, которые имеют спиральный способ встраивания во внешнюю мембрану, могут закреплять Ps1.

Чтобы исследовать, вносят ли поверхностная ассоциация и спиральный паттерн локализации Psl вклад в образование биопленок, мы использовали целлюлазу, которая нацелена на β-1,3 или β-1,4-связанные глюканы [28]. Ранее анализ химического состава и окрашивание конго красным [18], [21], [29] показали, что экзополисахарид Psl содержит β-1,3 или β-1,4-связанную глюкозу. Целлюлаза легко гидролизовала Psl и устраняла спиральное распределение Psl с поверхности клетки (рис. 2А). Без целлюлазы большинство клеток имели Psl, связанный с клеточной поверхностью.При обработке целлюлазой Psl, по-видимому, отделялся от бактериальной поверхности, даже несмотря на то, что общая интенсивность флуоресценции была сходной между обработанными целлюлазой и необработанными образцами. Более того, когда Psl диссоциировал с бактериальной поверхности, он, по-видимому, прикреплялся к покровному стеклу (белая стрелка, рис. 2А). Неожиданно анализы прикрепления кристаллического фиолетового [30] показали, что клетки PAO1, обработанные целлюлазой в течение ночи, были способны прикрепляться так же, как и необработанные клетки (данные не показаны). Эти данные показывают, что целлюлаза может высвобождать Psl с поверхности бактериальных клеток без разрушения основного полимера Psl, а расщепленный целлюлазой Ps1 способен прикрепляться к субстрату.Эти данные также предполагают, что β-1,3- или β-1,4-связанная глюкоза может быть моносахаридом, который связывает Psl с бактериальной поверхностью.

Рис. 2. Влияние лечения целлюлазой на локализацию Psl и образование биопленок.

(A) Окрашивание HHA-FITC (зеленый) поверхностно-прикрепленных клеток WFPA801 с обработкой целлюлазой или без нее. (B) Биопленки GFP-меченного PAO1, выращенные в проточных клетках в присутствии или в отсутствие целлюлазы. Общая биомасса была определена количественно с помощью программного обеспечения COMSTAT. Значения, показанные в верхнем левом углу соответствующего изображения, были нормализованы к результату образца лечения без целлюлазы (3.1 мкм ³ / мкм ² ). Стрелки показывают Psl, который отделился от бактериальной поверхности и прикрепился к субстрату. Масштабные линейки, 1 мкм для панели A и 5 мкм для панели B.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000354.g002

Чтобы проверить влияние целлюлазы на образование биопленок в условиях потока, мы вырастили штамм PAO1, меченный GFP, в отсутствие или постоянное присутствие целлюлазы. В этих условиях лечение целлюлазой резко снижает развитие биопленок (рис. 2В).Этот фенотип биопленки подобен фенотипу, наблюдаемому у штамма Δpsl [18]. Анализ COMSTAT [31] показал, что общая поверхностно-связанная биомасса обработанного целлюлазой PAO1 составляла всего 1% по сравнению с аналогичным образом выращенным необработанным PAO1. Это различие не было связано с ингибированием роста, поскольку PAO1, выращенный в присутствии или в отсутствие целлюлазы, имел сходные скорости роста (данные не показаны). Мы не можем исключить возможность того, что целлюлаза косвенно влияет на ассоциацию Psl с клеточной поверхностью, например нацеливание на один или несколько β-1,3- или β-1,4-связанных глюканов, которые связываются с Psl.Независимо от механизма, эти данные показывают, что поверхностная ассоциация Psl важна для P. aeruginosa , чтобы инициировать биопленку.

На ранней стадии развития биопленки Psl образует матрикс, удерживающий клетки бактерий в биопленке и на поверхности

Чтобы обнаружить матрицу Psl биопленок на ранних стадиях развития, мы использовали флуоресцентно меченые лектины Psl для окрашивания живых биопленок, выращенных в камерах проточных кювет (рис. 3A, 3E, 3I, 3M). Были оценены PAO1 дикого типа, штамм WFPA801, сверхпродуцирующий Psl, и мутантный штамм WFPA800 psl .Бактерии были окрашены в красный цвет с использованием мембранного красителя FM4-64 (рис. 3B, 3F, 3J) или помечены GFP (рис. 3N, 3R). Psl был легко визуализирован с использованием HHA-FITC (зеленый) или с MOA-TRITC (красный) и сформировал матрицу в WFPA801 и PAO1 (зеленый на рис. 3A, 3E и красный на рис. 3M), но не в клетках штамма Δpsl . WFPA800 (рисунок 3I). В большинстве случаев материал матрикса Psl был связан с бактериальными клетками, что можно было наблюдать в окрашенной FITC-HHA биопленке WFPA801 (рис. 3A – 3C) и в окрашенном TRITC-MOA матрице (рис. 3M – 30).Интересно, что материал матрикса Psl также был обнаружен в областях, где не было бактериальных клеток (рис. 3C, 3G и данные не показаны). Неясно, был ли этот Psl высвобожден из клеток или остается прикрепленным к поверхности клетки. Этот свободный матричный материал Psl может способствовать прикреплению к поверхностям или играть роль в привлечении планктонных бактерий к биопленке. Приведенные выше результаты также подтверждают, что Psl способствует взаимодействиям клетка-клетка и клеточная поверхность. Это происходит за счет того, что Psl способствует прилипанию к поверхностям (рис. 3A, 3E и 3M), окружающим клеткам, соединению клеток вместе и привлечению клеток к поверхности (рис. 3C, 3G, 30).В результате образуется матрица, удерживающая бактериальные клетки в биопленке и на поверхности.

Рис. 3. Psl на ранней стадии развития биопленки: матрица, образованная Psl, удерживающая бактериальные клетки в биопленке и на поверхности.

(A – D) Окрашивание матрицы Psl в биопленках, образованных штаммами PAO1, WFPA801 и WFPA800: изображения были получены через 20 часов в среде Дженсена в условиях непрерывного потока с 2% арабинозы. Биопленки в реакторах окрашивали в течение 2 часов лектинами следующим образом: HHA-FITC и FM4-64 окрашивали биопленку WFPA801.(E – H) Биопленка PAO1, окрашенная HHA-FITC и FM4-64. (I – L) Биопленка WFPA800, окрашенная HHA-FITC и FM4-64. (M – P) Окрашивание MOA-TRITC биопленки WFPA801, меченной GFP. (Q – T) MOA-TRITC окрашивание GFP-меченой биопленки PAO1, выращенной в условиях потока в среде Дженсена с целлюлазой. Масштабные линейки 5 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000354.g003

Чтобы определить, может ли матрикс Psl формироваться при продолжении обработки целлюлазой, MOA-TRITC использовали для окрашивания биопленки PAO1, меченной GFP, выращенной в присутствие целлюлазы в условиях потока в течение 20 часов.PAO1 был серьезно скомпрометирован в своей способности формировать матрицу Psl (Рисунок 3Q), что согласуется с фенотипом биопленки в этих условиях (Рисунок 2B и Рисунок 3Q). Это указывало на то, что биопленка не могла развиваться, если образование матрикса было ингибировано. Поскольку целлюлаза диссоциировала Psl с бактериальной поверхности и устраняла спиральное распределение Psl, эти данные убедительно свидетельствуют о том, что свойство Psl заякоривать на клеточной поверхности необходимо для Psl, чтобы способствовать межклеточным взаимодействиям, и это взаимодействие является критическим для Psl, чтобы инициировать матрикс под условия потока.

Как матрица Psl поддерживает архитектуру биопленки

В зависимости от условий биопленки могут образовывать плоские многослойные структуры или микроколонии, которые имеют определенное трехмерное расположение. Чтобы визуализировать, как матрица Psl поддерживает архитектуру биопленок, мы изучили распределение Psl в этих двух типах сообществ путем оптического сечения биопленок, окрашенных MOA. В плоской биопленке WFPA801 матрица Psl была равномерно распределена и связана с бактериальными клетками (рис. 4A).Однако в четко определенной трехмерной структуре микроколонии матрица Psl была распределена неравномерно. Это было визуализировано на репрезентативных горизонтальных Z-изображениях микроколонии (Рисунок 4B, левая и средняя панели), трехмерной реконструкции микроколонии (Рисунок 4B, правая панель) или серии Z-стопок размером 1 мкм реконструированной микроколонии. в файл фильма (Видео S1). Здесь усиленное окрашивание лектина наблюдалось на периферии каждой микроколонии, а снижение окрашивания лектина наблюдалось в центре микроколоний (средняя панель на Фигуре 4B).В грибовидных микроколониях небольшое окрашивание Psl было обнаружено в нижнем центре (область от центра микроколонии до площади поверхности, левая панель на Фигуре 4B). Этот образец окрашивания привел к образованию полости без матрикса в нижнем центре грибовидной микроколонии. В некоторых случаях, например, в микроколонии рядом с субстратом, в центре было меньше бактерий, чем на периферии микроколонии (левая панель, рис. 4В). Однако в верхней части микроколонии не было большой разницы в плотности клеток в центре и на периферии (рис. 4B, средняя панель).Это наблюдали при окрашивании микроколоний либо FM4-64 (рис. 4B), либо когда клетки экспрессировали GFP (видео S1). Аналогичный паттерн распределения матрикса наблюдали при использовании PAO1 дикого типа, выращенного в биопленках, что указывает на то, что паттерн окрашивания Psl в биопленках не был обусловлен избыточным продуцированием Ps1 (данные не показаны). Psl не был обнаружен ни в многослойных биопленках, ни в микроколониях, образованных штаммом Δpsl WFPA800 (данные не показаны). В целом, наши данные показывают, что Psl окружает составляющие клетки либо в многослойной биопленке, либо в 3D-структурированной микроколонии (см. 3D-вид микроколонии на правой панели рисунка 4B и серию Z-стеков в видео S1).

Рис. 4. Как матрица Psl поддерживает архитектуру биопленки.

Показаны наборы оптических срезов изображений, полученных в разных местах биопленки (положение указано в верхней части каждой панели). Изображения DIC отображаются серым цветом. Объединенные изображения зеленого и красного показаны в нижнем правом углу для панелей A и B. Полоса, 5 мкм для панелей A и B, 10 мкм для панелей C и D. (A) Матрица Psl (зеленый, окрашивание MOA-FITC, внизу слева) в многослойной биопленке (толщиной 4 мкм) из WFPA801 (красный, окрашивание FM4-64, вверху слева).(B) Матрица Psl (зеленый, окрашивание MOA-FITC, внизу слева) в микроколонии биопленки WFPA801 (окрашивание FM4-64, толщина 24 мкм, вверху слева). Показаны вид сверху вниз (квадрат) и вид сбоку (прямоугольник) воссозданных трехмерных изображений, которые показывают, как локализованная на периферии матрица Psl окружает бактерии грибовидной микроколонией. (C) Недавно синтезированная матрица Psl (красный цвет) покрывает существующую матрицу Psl (зеленый цвет). Матрикс Ps1 биопленок WFPA801 окрашивали MOA-FITC (зеленый) при 40-часовом росте и снова окрашивали MOA-TRITC (красный) при 60-часовом росте.Большое квадратное изображение представляет собой горизонтальный участок в верхней части микроколонии. Синяя линия на изображениях вида сбоку отмечает расположение разреза (прямоугольник). Объединенные зеленые и серые изображения находятся в правом нижнем углу. Объединенные зеленые и красные изображения находятся на правой панели и в нижней части средней панели.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000354.g004

Хотя в некоторых микроколониях действительно выявлено ограниченное окрашивание Psl в центре полости матрикса Psl, в большинстве случаев окрашивание Psl было периферическим.Чтобы убедиться, что полость матрицы Psl в центре микроколонии не является артефактом неполной диффузии лектина, мы увеличили концентрацию лектина в 5 раз и удвоили время инкубации. Однако картина окрашивания не изменилась, и полость матрикса все еще наблюдалась (данные не показаны). Чтобы определить, является ли размер лектина (~ 50 кДа) ограничивающим фактором диффузии в микроколонии, мы использовали 70 кДа меченных FITC гранул декстрана для окрашивания микроколоний. Гранулы декстрана легко проникали в нижний центр микроколоний (данные не показаны).Следовательно, появление полости матрицы Psl, вероятно, связано с уменьшением Psl в центре микроколонии, а не с недостаточным проникновением лектина.

Чтобы исследовать, где в микроколонии находится вновь синтезированный Psl и как существующий матрикс Psl может измениться во время роста биопленки, мы пульсируем окрашенные биопленки с MOA-FITC (зеленый) при 40-часовом росте с последующим окрашиванием MOA-TRITC (красный) через 60 часов. рост. Через 40 часов в центре микроколоний наблюдалось значительное окрашивание Psl (зеленое пятно, рис. 4С, левая панель).К 60-часовой временной точке большая часть окрашивания Psl была локализована периферически. Недавно синтезированный Psl (рис. 4C, красный) покрыл уже существующий матрикс Psl (рис. 4C, зеленый), и в центре микроколонии было небольшое окрашивание вновь синтезированного Psl. Эти данные свидетельствуют о том, что бактерии в центре микроколонии не производят постоянно Psl. Вместо этого уже существующий Psl накапливается в своем первоначальном периферийном местоположении, указывая на то, что деградация Psl может происходить в центре микроколоний.Поскольку бактерии на периферии активно синтезируют Psl, периферическое накопление Psl может быть связано с взаимодействиями ассоциированного с клеткой Psl со свободным Psl в матриксе. Конечный результат — область без матрицы Psl в центре микроколонии (Рисунок 4C, сравните зеленые изображения на левой панели со средней панелью).

Периферическая локализация Psl может быть важна для поддержания трехмерной структуры микроколонии, а также для обеспечения сцепления с поверхностью. Периферический Psl может также задействовать свободно плавающие планктонные бактерии в микроколонии (например,грамм. объединенное изображение на рисунке 4B, средняя панель). Периферическое окрашивание Psl в микроколонии, по-видимому, не является результатом различий в транскрипции psl , поскольку и PAO1 дикого типа, и Psl-индуцибельный штамм WFPA801 показали сходный характер распределения Psl. Бактерии в центре микроколонии могут продуцировать меньше Psl из-за нехватки питательных веществ или из-за механизма посттранскрипционного контроля. Уровень внутриклеточного циклического ди-гуанилата контролирует продукцию экзополисахаридов Psl и Pel [32], [33].Возможно, градиенты питательных веществ в микроколонии [34], [35] приводят к градиентам внутриклеточного циклического ди-гуанилата от периферии (самый высокий) к центру микроколонии (самый низкий), что может объяснить изменения в локализации Psl. У стафилококков и P. aeruginosa активная репликация ДНК и синтез белка наблюдались на периферии микроколоний биопленок [34], [36]. Таким образом, повышенная метаболическая активность также может быть одним из факторов, которые приводят к периферической локализации Psl в микроколонии.Альтернативно, ферменты, высвобождаемые бактериями в центре микроколонии, могут разрушать уже существующий матрикс Psl.

Полость матрицы Psl подготавливает биопленки к будущему рассеянию посевов

Далее мы провели окрашивание микроколоний лектином на стадии диспергирования биопленок. Об активной дисперсии свидетельствует присутствие многочисленных плавающих бактерий в центре старых микроколоний (см. Видео S2). Когда биопленки PAO1 окрашивались как HHA-FITC, так и FM4-64, матрица Psl опутывала бактерии в неподвижной стенке кластера (рис. 5A, область между черными стрелками), которая окружала область с плавающими клетками, подвергающимися рассеянию семян (рис. 5A). , белые стрелки).Маленькая матрица Psl была обнаружена в области с плавающими клетками, расположенными в нижнем центре микроколонии (рис. 5A и видео S2). Полость матрикса Psl также присутствовала в центре микроколонии PAO1 без видимых плавающих клеток (рис. 5C), как мы наблюдали в микроколонии WFPA801 (рис. 4B). Это говорит о том, что полость матрикса Psl в центре микроколонии должна быть подготовлена ​​до появления плавающих диспергирующих клеток. Матрица Psl микроколонии после диспергирования показала пустое отверстие в центре с неповрежденной оставшейся матрицей (рис. 5В).

Рис. 5. Матрица микроколоний Psl до и после диспергирования.

Панели A – C демонстрируют двухдневную биопленку PAO1, окрашенную HHA-FITC (зеленый) и FM4-64 (красный). Пруток, 10 мкм. (A) Матрица Psl микроколонии подвергается диспергированию (толщина 28 мкм). Слева — горизонтальное изображение матрицы (квадрат) вблизи поверхности и два вертикальных разреза матрицы (прямоугольник). Маленькие квадраты справа показывают изображения в горизонтальном разрезе из середины той же микроколонии.Белые стрелки указывают на области с плавающими диспергирующими клетками, а две черные стрелки указывают на неподвижную бактериальную стенку. Объединенное изображение показывает, как матрица Psl опутывала бактерии в неподвижной стенке и покрывала диспергирующие клетки в полости матрицы. (B) Матрица Psl микроколонии после рассева семян. Показаны изображение с горизонтальным сечением (квадрат) микроколонии в верхней части и два изображения с вертикальным сечением (прямоугольник). (C) Полость матрикса Psl в микроколонии (толщина 33 мкм) без видимых плавающих клеток.Справа показано горизонтальное изображение матрицы, расположенной близко к поверхности (квадрат), и два вертикальных разреза матрицы (прямоугольник). Большая белая стрелка указывает на окрашивание Psl в центре полости матрицы Psl. Показаны два набора изображений, разделенных на верхнюю часть микроколонии (средняя панель) или близко к поверхности (левая панель).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000354.g005

Гибель и лизис клеток способствует формированию полости матрикса Psl и развитию биопленок

Модель P.Матрикс биопленки aeruginosa содержит значительное количество внеклеточной ДНК (эДНК [10], [12], [13]. Считается, что автолиз клеток, который происходит в микроколониях, опосредует высвобождение эДНК [19]. Исследовать, где локализуются Psl и eDNA в матрице биопленки мы выполнили окрашивание лектина HHA-FITC и йодида пропидия (PI) (рис. 6A). PI будет окрашивать eDNA или ДНК в клетках с поврежденной клеточной мембраной. Результаты показали, что между Psl (зеленый) было небольшое перекрытие и эДНК (диффузный красный) или проницаемые через мембрану клетки (рис. 6А, верхняя панель, ярко-красный цвет; в дальнейшем эти клетки были названы «мертвыми»).В трехмерных микроколониях WFPA801 (рис. 6А) мертвые клетки и эДНК в основном располагались в области с небольшим матриксом Psl. Интересно, что мертвые клетки были сконцентрированы в области, близкой к субстрату, и в частях стеблей грибовидных микроколоний, которые также были местом полости матрикса. Это наиболее очевидно на реконструированных изображениях вида сбоку (прямоугольники в центре рисунка 6А).

Рисунок 6. Гибель и лизис клеток способствует формированию полости матрикса Psl.

На панели A матрица Psl была окрашена зеленым, тогда как на панели B зеленый флуоресцентный сигнал представляет жизнеспособные клетки, окрашенные SYTO9. На всех панелях красная флуоресценция обусловлена ​​окрашиванием йодидом пропидия (PI) либо эДНК (слабый и диффузный красный), либо клеток с поврежденной клеточной мембраной (мертвые клетки, ярко-концентрированный красный). Полоса, 5 мкм для WFPA801 на панели A и 10 мкм для других изображений. (A) Изображения двухдневных биопленок мутантов WFPA801 и rpoN , окрашенных HHA-FITC (зеленый) и PI (красный).На левой панели показан вид сверху вниз восстановленных трехмерных изображений. На правой панели показаны наборы изображений, оптически разделенных (по горизонтали) на шейке одной и той же микроколонии. Соответствующее объединенное изображение матрицы Psl и матрицы ДНК показано на средней панели (большой квадрат). Также показаны два соответствующих изображения вертикального разреза (прямоугольник). (B) Окрашивание жизнеспособности PAO1 и WFPA801 на жизнеспособность микроколоний биопленок PAO1 и WFPA801 показывает, что в нижнем центре микроколонии есть жизнеспособные плавающие клетки и мертвые клетки / внеклеточная ДНК, которые заполняют все пустоты.Показаны три микроколонии до диспергирования и одна микроколония (вверху справа) после диспергирования. Стрелкой указаны плавательные клетки в центре микроколонии.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000354.g006

Чтобы изучить, коррелирует ли гибель клеток в микроколонии с формированием полости матрикса Psl, мы окрашивали мертвые клетки и матрицу Psl биопленок, образованных rpoN. мутантов. Эти штаммы имеют низкую гибель клеток в микроколонии биопленок [19], и это было подтверждено в нашем анализе (Рисунок 6A, нижняя панель).В отличие от того, что мы наблюдали с диким типом P. aeruginosa , Psl был одинаково распределен в центре и на периферии микроколоний мутанта rpoN (фиг. 6A). Аналогичные результаты были получены с мутантом fliM pilA , который также имел сниженную гибель клеток в микроколонии биопленок ([19], и данные не показаны). Мы также выполнили живое / мертвое окрашивание биопленок WFPA801 и PAO1, выращенных в тех же условиях, что и на рисунке 6A. Мы обнаружили многочисленные микроколонии на стадии до диспергирования, так как они имели плавающие клетки в центре микроколонии (см. Видео S3).Интересно, что мертвые клетки и эДНК заполнили пустоты внутри микроколоний и окружили плавающие клетки (рис. 6В, первые три изображения). Многочисленные мертвые клетки были обнаружены в пустотах при расселении микроколоний после посева (рис. 6В, изображение в правом верхнем углу). Пространство с плавающими клетками было расположено в той же области с мало обнаруживаемым Psl (Рисунок 6B, изображение в правом нижнем углу).

Предыдущие исследования показали, что обработка ДНКазой разрушает P.aeruginosa структурная целостность биопленки [19]. Мертвые клетки, которые имеют поврежденную клеточную мембрану, в конечном итоге высвобождают ДНК, которая может быть включена в матрицу эДНК или ускоряет гибель и лизис клеток [20]. Наши данные показывают, что, хотя компоненты Ps1 и ДНК матрицы не перекрываются, Ps1 и eDNA могут функционировать совместно, заключая бактерии в биопленку. Интересно, что область в микроколонии, которая имеет мало Psl, находится в одном месте с концентрированными мертвыми клетками, а затем и с плавающими клетками на стадии дисперсии.Более того, мутанты, у которых снижена гибель клеток, не образуют полости матрикса Psl. Эти данные свидетельствуют о том, что гибель и лизис клеток ответственны за формирование матричной полости в микроколонии.

Гены

P. aeruginosa cidAB и lrgAB контролируют гибель и лизис клеток, а также время распространения посева

Наши результаты (рис. 6), а также другие отчеты [10], [20], [37] показывают, что гибель и лизис клеток происходит в зависимости от их пространственной ориентации в биопленке, как это недавно было сообщено в S .aureus [38] — [40]. Это предполагает, что P. aeruginosa способен подвергаться форме запрограммированной гибели клеток, подобной апоптозу у высших организмов. Предыдущие исследования с использованием S. aureus показали, что белки CidA и LrgA действуют как холин и антихолин, соответственно, чтобы контролировать гибель клеток и время лизиса клеток [40]. Холины представляют собой кодируемые фагом небольшие интегральные мембранные белки, которые контролируют активность гидролаз муреина и время лизиса клетки-хозяина во время бактериофаговой инфекции, тогда как молекула антихолина противодействует активности холина [40].Холины являются привратниками процесса лизиса и в определенный момент времени могут образовывать большие дыры в цитоплазматической мембране фаг-инфицированных бактерий [41]. Ортологи cid / lrg присутствуют в различных бактериях, включая P. aeruginosa [38]. На основе структурного анализа, гомологии последовательностей и организации гена мы идентифицировали предполагаемый локус cidAB (PA3432-3431) и lrgAB (PA4014-4013) в P. aeruginosa (фигура 7A). Белок, кодируемый PA3432, был предварительно идентифицирован как CidA, поскольку он имел все структурные особенности холина.К ним относятся небольшой трансмембранный белок (129 аминокислот, четыре предполагаемых трансмембранных спирали, как показано черными прямоугольниками на рисунке 7A), гидрофобный N-конец и высокополярный заряженный C-концевой домен. Было определено, что PA4014 кодирует LrgA, который имеет характеристики антихолинового белка (рис. 7A). Как и в случае S. aureus , LrgA имеет сходство последовательностей с CidA, но LrgA имеет удлиненный N-конец, включающий два положительно заряженных остатка (аргинин), которые важны для функции антихолина [42].Подобно организации в S. aureus , ортологи P. aeruginosa cidA / lrgA имели cidB / lrgB , соответственно, непосредственно ниже и выше cidA (предполагаемый регулятор транскрипции ). cidR ).

Рисунок 7. Гены P. aeruginosa cidAB и lrgAB контролируют гибель и лизис клеток, а также время распределения посевов.

(A) Выравнивание последовательности между P.aeruginosa CidA (предполагаемый холин) и LrgA (предполагаемый анти-холин), предсказанная структура белка CidA и диаграмма генетической организации P. aeruginosa cid / lrg . Идентичные остатки между двумя последовательностями и остатки, отсутствующие в CidA, заштрихованы. Черный прямоугольник представляет последовательность, которая, по прогнозам, образует трансмембранную спираль. _, остатки, предположительно являющиеся цитоплазматическими; -, остатки, по прогнозам, являются периплазматическими. (B) Сравнение роста P. aeruginosa PAO1, Δ cidAB и Δ lrgAB (левый график) и соответствующих дополненных штаммов (правый график).(C) Полость матрикса Psl (зеленый, окрашивание HHA-FITC) в 2-дневной биопленке Δ lrgAB , PAO1 и мутант Δ cidAB . Показаны изображение с горизонтальным сечением (квадрат) и изображение с вертикальным сечением (прямоугольник). Белая полоса, обозначенная буквой «a», представляет высоту полости матрицы Psl, а полоса «b» показывает высоту соответствующей микроколонии (MC).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000354.g007

Изучить, контролирует ли предполагаемая система Cid / Lrg гибель и лизис клеток в P.aeruginosa , мы сконструировали cidAB и lrgAB в штаммах с делецией рамки. В течение 24-72-часового периода роста в жидкой культуре оба мутанта демонстрировали более высокие значения OD ₆₀₀ , чем родительский штамм PAO1 (Рисунок 7B, левый график). Однако оба мутанта имели такое же количество жизнеспособных клеток, что и PAO1 в эти моменты времени (на основании определения КОЕ; данные не показаны). Это похоже на фенотип мутантов cidA / lrgA в S.aureus [39]. Делеция либо cidAB , либо lrgAB , по-видимому, вызывала повышенную гибель клеток, приводящую к накоплению мертвых клеток и, следовательно, к увеличению значений OD ₆₀₀ . Более интересно, что лизис клеток произошел раньше у мутантов Δ cidAB и Δ lrgAB , чем у PAO1 (фиг. 7B, левый график). По сравнению с PAO1 и мутантом Δ lrgAB , мутант Δ cidAB , по-видимому, подвергался лизису с меньшей скоростью (фиг. 7B, левый график).В соответствии с этим фенотипом окрашивание биопленок живыми / мертвыми показало, что мутант Δ cidAB накапливал больше мертвых клеток в биопленке, чем PAO1 (данные не показаны). Штаммы, дополненные Δ cidAB и Δ lrgAB , имели лизис клеток, аналогичный тому, который наблюдался с PAO1 (фиг. 7B, правый график). В совокупности эти результаты предполагают, что предполагаемая система Cid / Lrg контролирует гибель клеток и время лизиса клеток у P. aeruginosa .

Чтобы определить, влияет ли система Cid / Lrg на P.aeruginosa , мы исследовали биопленки родительского дикого типа, мутантов Δ cidAB и Δ lrgAB . В выбранный момент времени ни одна из микроколоний, образованных штаммом дикого типа, и только одна из мутанта Δ cidAB не претерпела диспергирования (фигура 7C). Однако одна треть микроколоний Δ lrgAB подвергалась активному диспергированию. В соответствии с этими эффектами развития биопленок микроколонии мутанта Δ lrgAB образовывали более крупную матричную полость Psl, чем PAO1 (фиг. 7C).Это было оценено путем расчета отношения высоты полости матрицы (белая полоса, буква а на рисунке 7C) к высоте микроколонии (белая полоса, буква b на рисунке 7C; 0,49 ± 0,09 для мутанта Δ lrgAB и 0,28 ± 0,13 для родительского штамма PAO1). Данные были рассчитаны для 15 независимых микроколоний, и разница между Δ lrgAB и PAO1 была статистически значимой (P <0,001, t-критерий с двумя хвостами). В мутанте Δ cidAB не было четко определенной полости матрикса.Вместо этого Psl накапливается в центре микроколонии (рис. 7C, правая панель). Эти данные согласуются с поведением мутантов Δ cidAB и Δ lrgAB в жидких средах. По сравнению с родительским штаммом PAO1, мутант Δ cidAB имел большую гибель клеток, но уменьшал автолиз клеток, что приводило к накоплению Psl в центре микроколонии. Мутант Δ lrgAB также имел большую гибель клеток, но нормальную скорость лизиса клеток. Это привело к увеличению полости матрицы и преждевременному рассеянию посевного материала.В целом, приведенные выше результаты показали, что запрограммированная гибель и лизис клеток вносят вклад в формирование полости матрикса Psl и рассредоточение посевов, предполагая, что автолиз клеток важен для деградации и локализации Psl в микроколонии.

В совокупности мы предполагаем, что P. aeruginosa использует по крайней мере два механизма для создания области, свободной от матрикса Psl, в центре микроколоний. Во-первых, бактерии в центре микроколонии снижают синтез Psl, а во-вторых, часть бактерий претерпевает клеточную гибель и лизис, высвобождая бактериальный поверхностно-связанный Ps1, эДНК и, возможно, ферменты, которые могут разлагать Psl в центре и очищать область для будущие диспергирующие ячейки.Расщепление Psl также может быть усилено недавно описанным механизмом секвестрации катионов eDNA в биопленках P. aeruginosa [20].

Выводы

Репрезентативное изображение матрицы Psl на каждой стадии развития биопленки показано на рисунке 8B. В целом, матрица Psl остается нетронутой на всех стадиях развития биопленки, чтобы облегчить прилегание к поверхности и сохранить архитектуру биопленки. В моменты раннего развития Psl (красный) ассоциируется преимущественно с клетками (зелеными) на поверхности (Рисунок 8B, стадия I).Связанный с клеткой Psl связывает бактерии друг с другом, заключая каждую бактерию в матрицу (рис. 8B, стадия II). По-видимому, этому способствует спиральное распределение Psl в отдельных клетках. При дальнейшем развитии образуются множественные слои агрегатов клеток. В таких биопленках Psl покрывает всю структуру сверху вниз (рис. 8B, стадия III). Когда биопленка превращается в трехмерную микроколонию, Psl наблюдается на периферии, а не в центре микроколонии (рис. 8B, стадия-IV).Во время этого созревания матричная полость образуется в нижнем центре грибовидной микроколонии (рис. 8B, стадия-V-1), которая подготавливает биопленку к будущим событиям диспергирования. Полость матрикса и плавающие диспергирующие клетки расположены в области, близкой к субстрату, и в стебле грибовидной микроколонии. После рассева семян в центре матрицы остается большой промежуток, но остальная часть микроколонии остается нетронутой (рис. 8B, стадия-V-2). Расположение полости матрикса и рассеивающих клеток в нашем исследовании (Рисунок 6B, Рисунок 8B) находится на субстрате, что отличается от описанного другими, которые использовали методы световой микроскопии (Рисунок 8A) [4].Следует подчеркнуть, что результаты, полученные с помощью нашей экспериментальной системы, могут быть специфичными для P. aeruginosa и без подтверждающих данных не могут быть экстраполированы на другие системы.

Рис. 8. Как формируется и развивается матрица биопленки P. aeruginosa Psl.

(A) Схема, показывающая пять стадий развития биопленки. Создано П. Дирксом, К. Зауэром и Д. Дэвисом и используется с разрешения авторов [4] и Ежегодного обзора микробиологии , , том 56 ©, 2002, Annual Reviews (www.Annualreviews.org). (B) Выбранные изображения окрашивания Psl (красный) на каждой стадии развития образования биопленки. Сигнал зеленой флуоресценции происходит от GFP-меченного P. aeruginosa . Кружком на изображении V-I изображена полость матрицы Psl. (C) Предлагаемый механизм, показывающий, как микроколония P. aeruginosa приносит в жертву часть клеток в центре и разрушает существующий матрикс, чтобы освободить клетки для диспергирования. Розовый материал представляет матрицу Psl, светло-зеленые клетки представляют живые бактерии, а темно-зеленые клетки представляют мертвые бактерии, подвергающиеся автолизу.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000354.g008

Мы предлагаем механизм использования P. aeruginosa запрограммированной гибели и лизиса клеток для создания полости матрикса, чтобы освободить часть клеток для будущего рассеивания (Рисунок 8C). Микроколония жертвует частью клеток, которые подвергаются автолизу в центре (темно-зеленые клетки на рисунке 8C). Это высвободит Psl, связанный с поверхностью этих клеток, и разрушит существующую матрицу.Лизис клеток также высвобождает эДНК, питательные вещества и ферменты, которые могут разрушать компоненты матрикса [20]. Это освободит некоторые жизнеспособные клетки из матрицы и освободит место для плавающих клеток. Питательные вещества, высвобождаемые из мертвых и лизированных клеток, могут поддерживать рост плавающей и рассеивающейся популяции. Тот же механизм можно использовать для разрушения матрикса в верхней части микроколонии, чтобы расчистить путь для диспергирования клеток. Диспергированные клетки, представляющие «второе поколение», занимают новую поверхность и повторно инициируют цикл, как показано на Рисунке 8A [4].

Многие полисахариды служат волокнистыми и матричными материалами, поддерживающими структуру клеточных сообществ растений и животных [43]. В этом отчете мы показали, что полисахарид Psl также служит волокнистым матриксным веществом, которое окружает бактерии биопленкой, образуя бактериальную «ткань». Что еще более интересно, P. aeruginosa претерпевает гибель клеток и лизис, чтобы разрушить матрикс Psl в центре микроколонии для будущего расселения посевов. Эта программа похожа на развитие многих высших организмов, включая апоптоз и быструю деградацию компонентов матрикса во время метаморфоза у земноводных.

Таким образом, мы показали, что полисахарид Psl P. aeruginosa образует матрицу, которая облегчает сцепление с поверхностью и поддерживает архитектуру биопленки во время цикла развития биопленки. Более того, матрица Psl, по-видимому, не перекрывается с матрицей eDNA, но, по-видимому, координирует деятельность для поддержания структуры биопленки. В целом, наши данные показывают, что Psl является ключевым компонентом каркаса биопленки P. aeruginosa , свойство, которое, вероятно, играет решающую роль в P.aeruginosa стойкость. Лучшее понимание формирования матрикса биопленки и ультраструктуры может открыть возможности для лечения связанных с биопленкой осложнений в медицинских, промышленных и экологических условиях.

Эволюционное расширение апикального внеклеточного матрикса необходимо для удлинения клеток в новой структуре

[Примечание редакции: авторы повторно представили исправленную версию статьи на рассмотрение. Далее следует ответ авторов на первый раунд обзора.]

Статья была значительно улучшена с учетом отзывов рецензентов. Мы провели дополнительные эксперименты и добавили важные данные для почти

каждого комментария и беспокойства рецензента. Хотя один запрошенный эксперимент не был

, мы подробно описываем в нашем ответе, насколько этот предлагаемый эксперимент невозможен, а

описывают текущие практики и теоретические основы области evo-DevO, на которых основаны наши выводы.

Рецензент №1:

Рукопись Смита и его коллег исследует основу развития новой структуры и то, как она могла развиваться. Авторы сосредотачиваются на задней доле Drosophila melanogaster , структуре, которая недавно возникла у этого вида и отсутствует у близкородственных дрозофилид. С помощью серии экспериментов авторы показывают, что задняя доля формируется в основном за счет увеличения высоты клеток, а не за счет пролиферации или интеркаляции клеток.Более того, авторы могут приписать это изменение размера клеток присутствию апикального внеклеточного матрикса (aECM) и, в частности, белку aECM Dumpy. Эти результаты указывают на важную роль aECM в эволюции генитальных структур у дрозофилид.

Рукопись кажется хорошо написанной, эксперименты кажутся хорошо проведенными, а тема и вопрос имеют важное значение для эволюционной биологии развития.

Мы благодарим рецензента за комментарии и мнение о нашей работе.

Рецензент № 2:

В этой рукописи Smith et al. Исследуют морфологическую основу недавно появившейся и новой структуры, задней доли самца у Drosophila melanogaster . Задняя доля (PL), отросток гениталий, необходимый для копуляции, появляется только в кладе melanogaster у Drosophila, но не у более отдаленных видов. Авторы изображают PL с боковой пластинки на определенных стадиях у D. melanogaster по сравнению с неметаллическим видом, D.Биармайп . Рост PL во время развития и отщепления от боковой пластинки не происходит из-за пролиферации или интеркаляции клеток. Вместо этого авторы предполагают, что рост PL происходит из удлинения клеток; мембранный маркер показывает, что клетки охватывают длину от базальной до апикальной поверхности PL. Толщина PL изменяется во время развития, указывая на то, что развитие ткани PL является динамичным. Затем авт. Исследуют клеточную и внеклеточную основу морфогенеза PL.ФЛ обогащена F-актином и микротрубочками, что указывает на то, что цитоскелет может вносить вклад в форму и рост. Однако авт. Обнаруживают, что апикальный внеклеточный матрикс, обогащенный Dumpy-YFP (aECM), связан с развивающейся PL, особенно на вершине PL на поздних стадиях. Кроме того, экспрессия Dumpy РНК распространяется на развивающуюся PL у лопастных, но не лопастных видов. Затем авторы показывают, что лектин VVA похож на aECM Dumpy-YFP. Эта сеть aECM отличается у нелопастных видов по сравнению с D.melanogaster, предполагая, что Dumpy-aEM помогает формировать морфогенез PL. Наконец, авт. Демонстрируют, что PL снижается и меняет форму, когда Dumpy сбивается с помощью RNAi у D. melanogaster. Изменения PL коррелируют с измененной организацией AECM Dumpy-YFP. Авт. Заключают, что aECM необходим для развития PL у лопастных видов, но может иметь разные функции в генитальном морфогенезе нелопастных видов.

В целом, это хорошо написанная рукопись с очень четкими изображениями и видео.Это важная тема, представляющая общий интерес для биологов развития, особенно тех, кто интересуется эволюционными основами морфологии тканей. Однако для усиления выводов было бы полезно уточнить несколько моментов.

Спасибо за очень внимательное чтение нашей рукописи и понимание темы и наших выводов. Мы рассмотрели все поднятые ниже комментарии, добавив дополнительные эксперименты и модификации.

Во-первых, авторы используют систему Raeppli для маркировки клеток мембранным маркером и показывают, что PL имеет толщину в одну клетку, которая продолжает расти / удлиняться.Авторы могли пояснить, почему они использовали именно этот метод, а не обычный FLP-out клон привязанного к мембране GFP (например, UAS-PLCδPH-GFP или UAS-mCD8-GFP). Меня также беспокоит низкое число N (n = 4 клона). Обозначили ли авторы и изобразили ли дополнительные клетки PL на разных стадиях развития, чтобы более убедительно показать, что эпителий представляет собой только один клеточный слой по всей ширине ткани?

Мы увеличили N для этого эксперимента до 10.Первоначально мы стремились использовать систему Raeppli для маркировки нескольких ячеек разными цветами. Хотя это не сработало в наших руках (вероятно, из-за недостаточной активации репортеров, так что был обнаружен только один цвет), это позволило нам измерить высоту отдельных клеток. Мы также отмечаем, что окрашивание микротрубочек в различные моменты времени показывает апикобазальную полярность, согласующуюся с наблюдениями в эксперименте Raeppli. Мы объясняем обоснование нашего подхода в разделе «Методы»:

«Хотя эта система предназначена для маркировки ячеек несколькими цветами (Kanca et al., 2014), мы смогли обнаружить mTFP1 только в тканях, подвергшихся тепловому шоку, что, как мы подозреваем, вызвано недостаточной активацией других флуоресцентных репортеров до обнаруживаемых уровней ». (подраздел «Иммуноокрашивание и гибридизация in situ»).

Во-вторых, авт. Используют VVA-FITC для маркировки aECM у других видов Drosophila. Могут ли авторы подтвердить, что VVA маркирует те же структуры aECM, что и Dumpy-YFP в D. melanogaster ? Если это так, это будет иметь большое значение для проверки VVA как отличного прокси для Dumpy.Похоже, что есть один коммерческий источник VVL / VVA-TRITC (Glycomatrix.com), который можно было бы использовать.

Мы попробовали множество лектинов, включая VVA-Texas Red, и тщательно сравнили их с DumpyYFP. Из них VVA-FITC показал наиболее четкую / воспроизводимую картину, которая соответствовала эксперименту Dumpy-YFP. Теперь мы более подробно документируем, как это было определено, на рис. 5, приложение 2, где мы показываем, как диагностические аспекты шаблона Dumpy отражаются VVA-FITC. Мы также показываем на рис. 7 — приложение к рис. 3, как сигнал VVA изменяется во время нокдауна Дампи, дополнительно подтверждая, что эти сигналы связаны не только простой корреляцией.Мы признаем, что aECM, вероятно, сложен, и VVA почти наверняка маркирует не только белок Dumpy. Однако наши эксперименты показывают, что VVA является полезным заместителем для aECM, ранее невиданной особенности генитального развития, которую теперь можно сравнивать между видами, используя этот метод.

В-третьих, авторы рассматривают Dumpy-YFP на фоне Dumpy RNAi (рис. 7C-F). Разве РНКи не должна нацеливаться на Dumpy-YFP и, таким образом, уменьшать его экспрессию? Это может изменить интерпретацию того, как aECM ассоциируется с вентральной частью PL.Визуализация VVA здесь может усилить эту ассоциацию.

Мы согласны с тем, что в этом эксперименте Dumpy RNAi будут нацелены как на дикий тип, так и на Dumpy с тегом YFP, и мы понимаем, что предыдущая формулировка не прояснила этот момент полностью. В самом деле, мы стремились изобразить Dumpy-YFP на фоне RNAi, чтобы более тщательно оценить, как проявляется фенотип Dumpy-RNAi. То, что мы видим оставшиеся связи в нокдауне, подтверждает, что нокдаун не является абсолютным, и показывает, что самые высокие клетки дефектной доли, тем не менее, являются теми, которые поддерживают связь с Dumpy-позитивным aECM.Мы изменили текст как таковой, чтобы сделать настройку этого эксперимента более понятной:

«Почему дорсальные клетки задней доли больше страдают от нокдауна? Мы предположили, что наш специфический для задней доли драйвер недостаточно силен, чтобы удалить все отложения Дампи, связанные с задней долей. Чтобы лучше понять это, мы исследовали локализацию Dumpy: YFP на фоне нокдауна, когда лечение RNAi должно быть нацелено как на dumpy, так и на dumpy: yfp ». (Подраздел «Корреляция кускового отложения и высоты клеток в задней доле».)

Чтобы ответить на точку зрения рецензента, мы теперь показываем окрашивание VVA Dumpy-RNAi на рисунке 7, приложение 3. Этот эксперимент подтверждает, что эти оставшиеся связи между самой высокой частью задней доли и aECM являются единственными очевидными связями в Dumpy- РНКи эксперимент.

В-четвертых, PL выглядит совершенно иначе внутри клады melanogaster (например, Glassford et al., 2015 показывает, что у simulans очень большая PL, а у mauritiana очень маленькая). Чем отличается aECM с меткой VVA у этих (или других) лопастных видов от melanogaster? Сходства / различия могут действительно усилить ассоциацию организации aECM и того, как форма PL развивается у лопастных и нелопастных видов.

Это отличный момент. Мы рассматриваем такой эксперимент как полезную демонстрацию того, что этот механизм, вероятно, является общим для всех лопастных видов, представляя морфогенетический процесс, который совпадает с происхождением этой структуры. По запросу рецензента мы добавили экспериментальное окрашивание VVA, чтобы показать, что он связан с задней долей другого вида ( D. sechellia ), морфология которого отличается от D. melanogaster (Рисунок 5 — приложение к рисунку 3 ).Хотя эта ассоциация коррелирует с уникальной формой доли у этого вида, мы считаем, что было бы чрезмерной интерпретацией сделать вывод, что это демонстрирует, что aECM вызывает различия в морфологии долей. Изучение такой проблемы потребует совсем другого типа изучения генетических вариантов между этими видами, которое продолжается. Однако данные демонстрируют, что этот механизм развился не только у D. melanogaster .

В-пятых, авторы заключают, что Dumpy необходим для правильного формирования задней доли.Данные, по-видимому, подтверждают роль Dumpy в скульптуре и формировании доли, поскольку PL все еще формируется у животных с RNAi-пустышкой. Или авторы думают, что в состоянии RNAi есть остаточная Dumpy, которая может объяснить формирование PL, хотя и в виде ткани меньшего размера с измененной формой? Альтернативно, имеет ли драйвер GAL4, используемый для нокдауна Dumpy, переменную экспрессию, которая может объяснить изменчивость фенотипов PL?

Это именно то, что мы думаем — когда мы нокаутируем Дампи, все еще остаются связи Дампи-YFP между оставшимися самыми высокими клетками доли и центрально локализованными отложениями aECM (рис. 7D).Эти отложения Dumpy в гениталиях очень концентрированы, и мы не смогли полностью устранить их с помощью RNAi с использованием различных драйверов. Таким образом, мы интерпретируем вариабельность фенотипа dumpy-RNAi как наиболее совместимую с вариабельной эффективностью нокдауна. Мы изменили текст, чтобы прояснить эту точку зрения:

«Почему дорсальные клетки задней доли больше страдают от нокдауна? Мы предположили, что наш специфический для задней доли драйвер недостаточно силен, чтобы удалить все отложения Дампи, связанные с задней долей.»(Подраздел« Корреляция кускового отложения и высоты клетки в задней доле »)

Наконец, авт. Д. Обсудить возможность того, что внутренние факторы, такие как цитоскелет, могут вносить вклад в морфогенез PL. Фенотипы, вызванные Dumpy RNAi, не являются полностью пенетрантными (например, PL все еще формируется, но имеет щель). Считают ли авторы, что комбинация внешних aECM вместе с изменениями цитоскелета вносит свой вклад? Есть ли какая-то роль апикального клеточного сужения эпителия, например, в формировании щели между PL и класпером, и что это может помочь формированию PL у этих видов?

Мы согласны с рецензентом в том, что, вероятно, действуют несколько механизмов.Мы распознаем возможные роли внутренних факторов в нескольких местах: раздел результатов, раздел обсуждения:

«Кроме того, мы предполагаем, что дополнительные процессы могут также вносить вклад в полный морфогенез задней доли, включая потенциальные внутренние процессы, которые могут способствовать наблюдаемым нами изменениям формы клеток, например, концентрации компонентов цитоскелета, которые мы наблюдали (Рисунок 3). . »(Подраздел« Интеграция клеток в уже существующую сеть aECM для создания морфологической новизны »)

Однако мы сосредоточили наше обсуждение в первую очередь на aECM, так как очень мало исследований изучали внешние факторы в морфогенезе эпителиальных структур, а сравнительные эволюционные исследования внешних факторов особенно редки.Таким образом, мы чувствовали, что акцент на aECM лучше всего подчеркивает важность нашей работы, полностью признавая существование внутренних механизмов.

Рецензент № 3:

Smith et al., Представляют тщательный анализ морфогенеза задней доли мужских гениталий Drosophila melanogaster и сравнивают этот морфогенетический процесс с недолопастными, но относительно близкими видами. Они обнаружили, что задняя доля формируется за счет значительного увеличения высоты клеток; что развивающиеся гениталии связаны со сложным апикальным внеклеточным матриксом; и что компонент этой матрицы, Dumpy, расширился в экспрессии у видов с лопастями и необходим для развития лопастей у D.Меланогастер . Эта работа присоединяется к другой недавней работе (рассмотренной во Введении), которая начинает раскрывать клеточную основу эволюционных изменений, и, как отмечают авторы, их работа является важным дополнением, поскольку она сосредоточена на новой структуре, а не на диверсификации родовая структура.

Эксперименты, по-видимому, были хорошо продуманы и строго выполнены, и информация, которую они предоставляют, является важной отправной точкой для понимания эволюции новизны этой модели (как ее происхождения, так и ее последующего разнообразия).

Мы благодарим рецензента за комментарий о строгости и важности наших исследований, а также за продуманные реакции и предложения, приведенные ниже.

Хотя это солидная работа, у меня есть сомнения относительно ее конечного воздействия. Неясно, были ли изменения в экспрессии Dumpy вообще причиной эволюции задней доли. Неудивительно, что разрушение Дампи, который прикрепляется к развивающейся доле, нарушает ее окончательную морфологию.Чего не хватает, так это дополнительного эксперимента с усилением функции: создает ли расширение экспрессии Dumpy у видов без долей что-нибудь похожее на новую долю? Конечно, такой эксперимент может оказаться невозможным на немодельной мухе, и если он будет проведен, он может дать трудно интерпретируемый отрицательный результат. Но тогда остается вопрос: как нам решить «главную надвигающуюся проблему в исследованиях evo-DevO», которую авторы отмечают в своем последнем предложении в разделе «Обсуждение») — какие генетические изменения лежат в основе клеточных изменений? Движение в этом направлении действительно было бы большим достижением, и мне кажется, что окончательное влияние настоящей работы заключается в том, насколько возможно будет выявить соответствующие генетические изменения, лежащие в основе новинки.У меня нет каких-либо конкретных экспериментов, которые можно было бы предложить (и я бы все равно не хотел предлагать крупные новые эксперименты), но неуверенность в достижении прогресса несколько ограничивает мой энтузиазм. Между тем, название («Расширение aECM лежит в основе морфогенеза…») немного вводит в заблуждение и должно больше отражать эту неопределенность.

Комментарии выше касаются нескольких взаимосвязанных проблем, ответы на которые будут даны в следующей последовательности:

1) Неясно, были ли изменения в экспрессии Dumpy вообще причиной эволюции задней доли.

Мы согласны с тем, что было бы трудно окончательно утверждать, что изменения в экспрессии Dumpy (либо на цис , либо на транс изменений) были причиной образования задней доли. Однако это не главный вывод этой статьи — наши результаты показывают, как расширение апикального внеклеточного матрикса связано и необходимо для новой структуры задней доли. Важно признать, что логика наших выводов следует общепринятой практике изучения новизны на макроэволюционных масштабах в области эволюции.В частности, один описывает особенность эволюционировавшего признака (например, паттерн экспрессии гена), показывает, насколько он уникален для видов, несущих признак, а затем демонстрирует (в лучшем случае), что признак необходим для формирования признака. Подобные выводы были сделаны в разной степени в отношении рогов жуков (Moczek and Rose, 2009), шлемов древесных прыгунов (Fisher et al., 2019; Prud’homme et al., 2011) и рисунков пигмента бабочек (Kunte et al. ., 2014; Мазо-Варгас и др., 2017; Рид и др., 2011).

2) Неудивительно, что разрушение Дампи, который прикрепляется к развивающейся доле, нарушает ее окончательную морфологию.

Мы согласны с тем, что нет ничего удивительного в том, чтобы увидеть фенотип, если кто-то знает об обширной сети aECM, связанной с задней долей, которую мы обнаружили. Мы могли бы утверждать, что то, что является удивительным, так это существование этой сложной сети aECM, которая показывает признаки эволюционирующих связей с клетками задней доли.

3) Чего не хватает, так это дополнительного эксперимента с усилением функции: создает ли расширение экспрессии Dumpy у видов без долей что-нибудь похожее на новую долю?

Мы хотели бы проверить достаточность изменений в Dumpy. Однако есть три причины, по которым это было бы практически невозможно выполнить.

Во-первых, мы сильно подозреваем, что aECM, помимо Dumpy, состоит из нескольких белков. Это может включать рецепторы, другие белки ZP, ферменты, которые модифицируют эти белки, и дополнительные компоненты, которые ждут открытия, поскольку клеточная биология aECM в значительной степени не изучена.Следовательно, мы согласны с рецензентом в том, что неправильное выражение только Дампи вряд ли вызовет существенный отклик само по себе. Обсудим эту возможность более подробно:

«Кроме того, хотя Дампи может потребоваться для развития задней доли, вероятно, также необходимы дополнительные компоненты aECM, включая факторы, которые ремоделируют aECM или рецепторы, которые прикрепляют aECM к клеткам». (подраздел «Интеграция клеток в уже существующую сеть aECM для создания морфологической новизны»)

Во-вторых, как проницательно отмечает рецензент, этот эксперимент технически сложен.Нам потребуются проверенные драйверы энхансера-Gal4 для экспрессии Dumpy у нелепестковых видов. Не просто любой драйвер, но тот, который имеет правильную пространственно-временную динамику для соединения ячеек латеральных пластин с другими частями сети aECM, чтобы механически соединять эти элементы вместе.

В-третьих, создание конструкции БПЛА для болванки само по себе является сложной задачей. Дампи кодирует белок размером 2,5 мегадальтона, а его КДНК имеют длину 40-50 килобаз. Таким образом, создание конструкции UAS для этого белка, вероятно, потребует трансгенных манипуляций в масштабе ВАС, которые не были обычным явлением для видов Drosophila за пределами D.melanogaster , и на самом деле, насколько нам известно, они даже не выполнялись для dumpy в D. melanogaster . Учитывая эти ограничения, мы надеемся, что рецензенты и редакторы увидят, что это масштабный проект, на выполнение которого у любой группы уйдет несколько лет, и который может не привести к положительным результатам по уважительным причинам, которые не отменяют наши выводы.

4) Но тогда остается вопрос: как нам решить «главную надвигающуюся проблему в исследованиях evo-DevO», которую авторы отмечают в своем последнем предложении (раздел «Обсуждение») — какие генетические изменения лежат в основе клеточных изменений? Движение в этом направлении действительно было бы большим достижением, и мне кажется, что окончательное влияние настоящей работы заключается в том, насколько возможно будет выявить соответствующие генетические изменения, лежащие в основе новинки.

Это комментарий к нашему последнему предложению обсуждения, которое мы написали с целью осветить будущее этой системы. Поэтому мы очень рады энтузиазму рецензента по поводу заявленного нами видения. Мы не согласны с вопросом о том, представляет ли представленная здесь работа «крупный прогресс». Очевидно, мы так думаем (по нескольким причинам):

— Задняя доля является единственным признаком, который может физически отличить наиболее изученные многоклеточные виды на планете от их ближайших родственников, но клеточная основа их образования не была изучена.

— Мы обнаруживаем, что мочка имеет высоту в одну ячейку. Это было неожиданно для нас и коллег, с которыми мы обсуждали наши выводы.

— Молекулярные основы экстремального апико-базального удлинения клеток изучены недостаточно.

— Апикальный ECM также является плохо изученным участником эпителиального морфогенеза и до сих пор не участвовал в морфологической эволюции.

— Генитальный aECM, который мы описываем, уникален среди апикальных ECM по своей сложности (соединение с множественными структурами) и своей ранее не описанной ролью в крайнем апикально-базальном удлинении эпителиальных клеток.

5) Между тем, название («Расширение aECM лежит в основе морфогенеза…») немного вводит в заблуждение и должно больше отражать эту неопределенность.

Мы изменили название, чтобы лучше отразить наши выводы:

«Эволюционное расширение апикального внеклеточного матрикса необходимо для удлинения клеток в новой структуре».

https://doi.org/10.7554/eLife.55965.sa2

Обзор нашего шампуня и кондиционера Matrix So Silver

Когда дело доходит до моего салонного цвета светлых волос, вы можете сказать, что я немного разборчив.Когда я иду в салон для доработки, я всегда говорю своему колористу, что хочу, чтобы мой оттенок выглядел как можно более прохладно и без латуни. Несмотря на то, что пепельные пряди без латуни всегда являются целью, правда в том, что между встречами трудно избежать нежелательных желтых оттенков. Вот почему я всегда использовал фиолетовые шампуни и кондиционеры, чтобы мой цвет оставался ярким и без латуни до следующей встречи со своим колористом.

Как ветеран-блондинка с 10-летним стажем и редактор красоты, я пробовала много (и я имею в виду много) фиолетовых шампуней и кондиционеров.Хотя есть так много формул, которые мне нравятся, шампунь и кондиционер Matrix Total Results So Silver стали одним из основных продуктов в моей повседневной уходе за волосами.

Продолжайте прокручивать, чтобы узнать все, что нужно знать о системе Matrix Total Results So Silver, а также мой полный обзор Matrix Total Results So Silver.

Что делает Matrix So Silver?

Если вы надеетесь избавиться от латуни в перерывах между посещениями салона, вам понадобится система Matrix Total Results So Silver в вашем распорядке дня.Matrix Total Results So Silver Purple Shampoo and Conditioner — это профессиональная осветляющая система, содержащая фиолетовые пигменты для придания оттенка медно-светлым волосам.

Эти формулы очищают и кондиционируют, нейтрализуя нежелательное медное тепло и устраняя тусклые желтые тона. Они добавляют яркости и освещают блики и все оттенки блонда, от серого до платинового.

Можете ли вы использовать Matrix So Silver каждый день?

Поскольку эти продукты содержат пигменты, мы рекомендуем использовать их один или два раза в неделю или всякий раз, когда ваш светлый оттенок нуждается в обновлении.Если вы не используете окрашивающие шампунь и кондиционер, вам следует очищать и кондиционировать с помощью безопасной для цвета системы, такой как шампунь и кондиционер Matrix Total Results Color Obsess.

Можно ли использовать Matrix So Silver на сухих волосах?

Если вы имеете дело с сухими волосами, вы все равно можете использовать систему Matrix Total Results So Silver. Кондиционер Total Results So Silver восстанавливает сухие, ломкие волосы и придает прядям сияющий и глянцевый вид.

Good hair day, автор: @jleighwebdoeshair.

Как я использую Matrix Total Results для серебряного шампуня и кондиционера в повседневной жизни

Перед пандемией я подкрашивала свои пепельно-русые волосы с тенью каждые шесть недель или около того. Теперь я вижу своего колориста каждые три месяца, так что вы можете себе представить, что я имею дело со своей изрядной долей латуни между встречами по подкрашиванию. Так как я провожу много времени дома, я на несколько месяцев отложила фиолетовый шампунь и кондиционер на второй план, и со временем моя яркая пепельная блондинка стала теплой.

Однако несколько недель назад я снова начал включать шампунь и кондиционер Matrix So Silver в свой распорядок дня — и был очень доволен результатами. Это не только дало мне быстрое и домашнее тонизирование, в котором я отчаянно нуждался, но и оставило мои пряди мягкими и здоровыми, пока я жду давно назревшей процедуры стрижки.

Не знаете, как добавить эти продукты в свой распорядок дня? Вот как я это делаю. Я начинаю с нанесения четверти количества шампуня Matrix Total Results So Silver Shampoo на волосы от кожи головы до кончиков и вспенивания, чтобы обеспечить равномерное распределение продукта.Совет от профессионала: если вы пытаетесь не пачкать руки, я рекомендую использовать перчатки при нанесении шампуня на пряди, поскольку формула суперпигментирована. Я оставляю продукт на волосах примерно на три минуты, прежде чем смыть его.

Когда шампунь полностью смыт, я перехожу к питательному кондиционеру Matrix Total Results So Silver Nourishing Conditioner. Я наношу кондиционер от средней длины до кончиков волос и смываю через несколько секунд.

Выйдя из душа, я распутываю гриву, наношу текстурирующий крем размером с десять центов и позволяю своим естественным волнистым прядям высохнуть на воздухе.

Если вы блондинка в салоне красоты, шампунь и кондиционер Matrix Total Results So Silver вам просто необходимы.

Ищете другие продукты для волос? Покупайте лучшие товары салонного качества на Hair.com.

Гистология, краситель Верхоффа, артикул

[1]

Белз Г.Г., Эластические свойства и функция Виндкесселя аорты человека.Сердечно-сосудистые препараты и терапия. 1995 фев [PubMed PMID: 7786838]

[2]

Казловская В., Малхотра С., Ламбе Дж., Идрисс М. Х., Элстон Д., Андрес С., Применение эластичного окрашивания Верхоффа-Ван Гизона в дерматопатологии. Журнал кожной патологии. 2013 фев [PubMed PMID: 23216221]

[3]

Персиваль К.Р., Ради З.А., модифицированное гистохимическое окрашивание эластина Верхоффа для характеристики модели легочной артериальной гипертензии.Европейский журнал гистохимии: EJH. 2016, 11 февраля [PubMed PMID: 26972717]

[4]

O’Connor WN, Valle S, Комбинация эластичного красителя Верхоффа и трихрома Массона для рутинной гистологии. Морилка. Июль 1982 г. [PubMed PMID: 6183794]

[6]

Гарви В., Фатхи А, Бигелоу Ф, Карпентер Б., Хименес С. Комбинированное пятно эластика, фибрина и коллагена.Морилка. 1987 ноя. [PubMed PMID: 2448920]

[7]

Buk SJ, Одновременная демонстрация эластики соединительной ткани и фибрина комбинированным окрашиванием трихрома Верхоффа эластик-мартиус-алый-синий. Морилка. 1984, янв [PubMed PMID: 6206618]

[8]

Цуй Дж. З., Тегерани А. Ю., Джетт К. А., Бернатчез П., ван Бримен К., Эсфандиарей М., Количественная оценка морфологии эластина и коллагена аорты и кожи при синдроме Марфана с помощью многофотонной микроскопии.Журнал структурной биологии. 2014 сен [PubMed PMID: 25086405]

[9]

Поттер К.А., Бессер Т.Э., Сердечно-сосудистые поражения при синдроме Марфана крупного рогатого скота. Ветеринарная патология. 1994 сентябрь [PubMed PMID: 7801427]

[10]

Лопес-Гимет Дж., Андилла Дж., Лоза-Альварес П., Эгеа Г. Морфологический подход с высоким разрешением для анализа повреждений эластичных пластинок восходящей аорты на мышиной модели синдрома Марфана.Научные отчеты. 2017 г., 4 мая [PubMed PMID: 28473723]

[11]

Marque V, Kieffer P, Gayraud B, Lartaud-Idjouadiene I, Ramirez F, Atkinson J, Механика и состав стенки аорты в модели синдрома Марфана у трансгенных мышей. Артериосклероз, тромбоз и сосудистая биология. Июль 2001 г. [PubMed PMID: 11451749]

[12]

Marconi B, Bobyr I, Campanati A, Molinelli E, Consales V, Brisigotti V, Scarpelli M, Racchini S, Offidani A, эластичная псевдоксантома и кожа: клинические проявления, гистопатология, патомеханизм, перспективы лечения.Исследование трудноизлечимых и редких заболеваний. 2015 август [PubMed PMID: 26361562]

[13]

Hosen MJ, Lamoen A, De Paepe A, Vanakker OM, Гистопатология эластической псевдоксантомы и родственных заболеваний: гистологические признаки и диагностические ключи. Scientifica. 2012 [PubMed PMID: 24278718]

[14]

COFFMAN JD, SOMMERS SC, Семейная эластическая псевдоксантома и порок клапанов сердца.Тираж. 1959, февраль [PubMed PMID: 13629785]

[15]

Giannotti S, Bottai V, Dell’osso G, Bugelli G, Cazzella N, Guido G, Elastofibroma dorsi: серия случаев редкой доброкачественной опухоли спины. Европейский журнал ортопедической хирургии и травматологии: ортопедия травматология. 2013 август [PubMed PMID: 23412196]

[16]

Chandrasekar CR, Grimer RJ, Carter SR, Tillman RM, Abudu A, Davies AM, Sumathi VP, Elastofibroma dorsi: необычная доброкачественная псевдоопухоль.Саркома. 2008 [PubMed PMID: 18382611]

[17]

Mortman KD, Hochheiser GM, Giblin EM, Manon-Matos Y, Frankel KM, Elastofibroma dorsi: клинико-патологический обзор 6 случаев. Летопись торакальной хирургии. 2007 г., май [PubMed PMID: 17462431]

[18]

Gun BD, Bahadir B, Behzatoglu K, Gun MO, Ozdamar SO, Elastofibroma: клинико-патологическое и иммуногистохимическое исследование семи случаев и обзор литературы.APMIS: acta patologica, microbiologica, etmunologica Scandinavica. 2007 фев [PubMed PMID: 17295677]

[19]

Patnayak R, Jena A, Settipalli S, Nagesh N, Elastofibroma: An Uncommon Tumor Revisited. Журнал кожной и эстетической хирургии. 2016, январь-март [PubMed PMID: 27081248]

[20]

Отто С.М., Куусисто Дж., Райхенбах Д.Д., Гоун А.М., О’Брайен К.Д., Характеристика раннего поражения «дегенеративного» клапанного стеноза аорты.Гистологические и иммуногистохимические исследования. Тираж. 1994, август [PubMed PMID: 7519131]

[21]

O’Brien KD, Reichenbach DD, Marcovina SM, Kuusisto J, Alpers CE, Otto CM, аполипопротеины B, (a) и E накапливаются в морфологически раннем поражении «дегенеративного» клапанного стеноза аорты. Артериосклероз, тромбоз и сосудистая биология. 1996 г., апр. [PubMed PMID: 8624774]

[22]

Роберт Л., Роберт А.М., Якото Б. Повторный визит эластин-эластаза-атеросклероза.Атеросклероз. 1998, октябрь [PubMed PMID: 9862271]

[23]

Морис П., Блез С., Гейрал С., Дебель Л., Лаффарг М., Хорнебек В., Дука Л., Фрагментация эластина и прогрессирование атеросклероза: концепция эластокинов. Тенденции сердечно-сосудистой медицины. 2013 август [PubMed PMID: 23561795]

[24]

ТЕЙЛОР Х. Э., Роль мукополисахаридов в патогенезе фиброза интимы и атеросклероза аорты человека.Американский журнал патологии. 1953, сентябрь-октябрь [PubMed PMID: 13092224]

[25]

Fung MA, Sharon VR, Ratnarathorn M, Konia TH, Barr KL, Mirmirani P, Образцы окрашивания эластином при первичной рубцовой алопеции. Журнал Американской академии дерматологии. Ноябрь 2013 г. [PubMed PMID: 24035210]

[26]

Пинкус Х., Дифференциальные структуры эластических волокон при рубцовом и не рубцовом облысении.Журнал кожной патологии. Июнь 1978 г. [PubMed PMID: 79579]

[27]

Elston DM, McCollough ML, Warschaw KE, Bergfeld WF, Эластичная ткань в рубцах и облысении. Журнал кожной патологии. 2000 Март [PubMed PMID: 10728818]

[28]

Камино Х., Там С., Тапиа Б., Туссент С. Использование иммуноокрашивания эластина улучшает оценку меланом, связанных с невусами.Журнал кожной патологии. 2009 август [PubMed PMID: 1

78]

[29]

Камино Х., Там С., Розес Д., Туссен С. Структура эластичных волокон в регрессирующей меланоме: гистохимическое и иммуногистохимическое исследование. Журнал кожной патологии. Июль 2010 г. [PubMed PMID: 20184666]

[30]

Jordan RC, Kahn HJ, From L, Jambrosic J, Иммуногистохимическая демонстрация актинически поврежденных эластических волокон в кератоакантомах: помощь в диагностике.Журнал кожной патологии. 1991 г., апр. [PubMed PMID: 1856347]

[31]

Tsuji T, Sawabe M, Эластичные волокна в рубцовой ткани: исследования с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии. Журнал кожной патологии. 1987 апр. [PubMed PMID: 3597912]

[32]

Ротен С.В., Бхат С., Бхаван Дж., Эластичные волокна в рубцовой ткани.Журнал кожной патологии. 1996 фев [PubMed PMID: 8720985]

[33]

Льюис К.Г., Беркович Л., Дилл С.В., Робинсон-Бостом Л., Приобретенные нарушения эластической ткани: Часть II. уменьшение эластической ткани. Журнал Американской академии дерматологии. 2004, август [PubMed PMID: 15280835]

[34]

Morava E, Lefeber DJ, Urban Z, de Meirleir L, Meinecke P, Gillessen Kaesbach G, Sykut-Cegielska J, Adamowicz M, Salafsky I, Ranells J, Lemyre E, van Reeuwijk J, Brunner HG, Wevers RA, Defining the фенотип аутосомно-рецессивного синдрома кутислакса с сочетанным врожденным дефектом гликозилирования.Европейский журнал генетики человека: EJHG. 2008, янв [PubMed PMID: 17971833]

Окраска гематоксилином и эозином (окраска H и E или окраска HE)

Метод окрашивания гематоксилином и эозином позволяет распознавать различные типы тканей и их морфологические изменения, особенно при диагностике рака. Гематоксилин имеет глубокий сине-фиолетовый цвет и окрашивает нуклеиновые кислоты в результате сложной, не до конца изученной реакции. Эозин имеет розовый цвет и неспецифически окрашивает белки.В типичной ткани ядра окрашены в синий цвет, тогда как цитоплазма и внеклеточный матрикс имеют разную степень розового окрашивания.

Окрашивание гематоксилином и эозином

является основным диагностическим красителем, используемым в гистологии и гистопатологии, включая применение в тонкоигольной аспирационной биопсии, залитой парафином ткани. Гематоксилин используется для демонстрации ядра клетки и его содержимого, наблюдая за глубиной цвета красителя и временем суспендирования образца в красителе.

Гематоксилин и эозин являются красителями, и, естественно, красители обладают высоким сродством к тканям, в зависимости от кислотности и / или щелочности красителей.

Объектив

Для демонстрации морфологии тканей и клеток.

Принцип

Гематоксилин экстрагируется из дерева Hematoxylon campechianum , на котором при окислении образуется гематеин из гематоксилина, красителя, используемого в технике окрашивания гематоксилином и эозином.Добавление протравы позволяет гематеину связываться с анионными элементами тканей. Гематоксилин без эозина действует как контрастное пятно в протоколах иммуногистохимии и гибридизации, в которых используются колориметрические субстраты (такие как щелочная фосфатаза или пероксидаза)

Эозиновый краситель — это кислотный краситель, следовательно, он имеет отрицательный заряд (эозинофильный). Следовательно, он окрашивает основные структуры клетки (ацидофилы), придавая им красный или розовый цвет, например, цитоплазма заряжена положительно, и поэтому она впитывает эозиновый краситель и приобретает розовый цвет.

Гематоксилиновые красители являются основными красителями, поэтому они заряжены положительно. Поэтому он окрашивает кислые структуры тканей и клеточных структур (базофильные) в пурпурно-синий цвет. Гематоксилин сам по себе не является основным. Он должен быть конъюгирован с протравой (солью алюминия) перед использованием, чтобы усилить его положительный заряд для эффективного связывания с компонентами ткани. Протрава, которая также определяет цвет пятна, связывается с тканью, затем гематоксилин связывается с протравой, образуя комплексную связь ткань-протрава-гематоксилин.Это окрасит ядра и тела хроматина в фиолетовый цвет.

Окрашивание

H&E можно разделить на три типа: прогрессивное, модифицированное прогрессивное и регрессивное. Прогрессивное окрашивание происходит без дифференциатора для удаления избытка красителя после добавления гематоксилина. Это вызывает окрашивание фона на заряженных предметных стеклах. В основном используется для окрашивания муцина. В то время как Модифицированный прогрессивный и регрессивный, используйте дифференциатор для удаления излишних красителей. Он используется для демонстрации содержимого ядра.

Реактивы

• Дистиллированная вода
• Квасцы гематоксилин
• Кислый спирт
• Водопроводная вода Скотта
• Краситель эозиновый

Процедура

Процедура упрощена до различных процессов: депарафинизация, обезвоживание, гематоксилин, дифференциация, воронение, эозин, обезвоживание, очистка, покровное скольжение.

Шаги включают:

1. Очистите секции дистиллированной водой.
2. Затем окрашивают ядра квасцами гематоксилином (Mayer’s) для фиксации ткани в течение примерно 5 минут.
3. Смойте пятно проточной водой из-под крана
4. Используя дифференциатор, 0,3% кислотный спирт, обратите внимание на конечную точку, т.е. правильная конечная точка — после посинения фон становится бесцветным.
5. Смойте пятно в проточной водопроводной воде.
6. Промойте атлас в заменителе водопроводной воды Скотта, который сокращает время достижения правильной конечной точки.
7. Промыть проточной водой из-под крана
8. Залейте мазок эозином в течение 2 минут, и, поскольку эозин хорошо растворяется в воде, используйте его для количественного определения. Излишне окрашенный эозин можно удалить или смыть проточной водой из-под крана.
9. Осушите мазок, очистите и нанесите на него чистое покровное стекло.

Результаты и интерпретация

Ядра окрашены в синий цвет, тогда как цитоплазма и внеклеточный матрикс имеют разную степень розового окрашивания.Хорошо закрепленные клетки демонстрируют значительные внутриядерные детали. Ядра демонстрируют различные характерные для клеточного и злокачественного типа паттерны конденсации гетерохроматина (окрашивание гематоксилином), которые очень важны с диагностической точки зрения. Окрашивание ядрышек эозином. Если присутствуют обильные полирибосомы, цитоплазма будет иметь отчетливый синий оттенок.

Рисунок: Ткань легкого, взятая у пациента с эмфиземой. Ядра клеток (сине-пурпурный), красные кровяные тельца (ярко-красные), тела других клеток и внеклеточный материал (розовый) и воздушные пространства (белые).Источник изображения: Википедия

Приложения

Он широко используется в гистопатологии, иммунохимии и иммунопатологии для анализа и демонстрации морфологии тканей и клеток.

Преимущество

Метод быстр в исполнении, дешев и может быть изменен

Ограничение

Гематоксилин и эозин неэффективны в том смысле, что не все свойства вещества могут быть получены, и необходимо использовать специальные красители.

Список литературы и источники

1. Окрашивание тканей и клеточных срезов гематоксилином и эозином. Фишер А.Х., Якобсон К.А., Роуз Дж., Целлер Р.
2. H&E Staining Overview: A Guide to Best Practices Синди Сампиас, Джеффри Роллс
3. Наука и применение окрашивания гематоксилином и эозином Скип Браун
4. https://www.